L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

Résumé

Une méthode pour l' élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l'hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l'alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.

Résumé

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

La plupart des animaux sont intimement associés à des bactéries ( «microbiote») de la naissance à la mort ^1. Les comparaisons de ( «classique») des animaux exempts de micro - organismes ( 'axénique') et un micro-organisme associé ont montré microbes influencent divers aspects de la santé animale, y compris métabolique, nutritionnel, vasculaire, hépatique, respiratoire, immunologique, endocrinien, et la fonction neurologique ^2. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle clé pour comprendre un grand nombre de ces processus dans la présence de microbes ^3,4 et pour l' étude microbiote influence sur ^5,6 de la santé animale. Aucune espèce bactérienne est présente dans chaque individu ( «noyau»), mais les espèces Acetobacter et Lactobacillus dominent numériquement le microbiote des deux élevés en laboratoire et sauvages capturés D. melanogaster. Acetobacteraceae autres (y compris Komagataeibacter et Gluconobacter) Firmicutes (comme Enterococcus et Leuconostoc), et entérobactéries sont soit souvent présent chez les individus de drosophile à faible abondance, ou irrégulièrement présent à forte abondance ^7-12.

Le microbiote de la drosophile et les mammifères est inconstante au sein et à travers les générations ^14,19. Microbiota inconsistance peut conduire à un bruit phénotypique lors de la mesure des traits de microbiote-dépendants. Par exemple, le stockage Acetobacteraceae influence lipides (triglycérides) chez la drosophile ^15-18. Si Acetobacteraceae sont plus abondants dans les mouches d'un flacon que dans un autre ^19, les mouches isogéniques peuvent avoir différents phénotypes ^20. Une solution pour le problème de microbiote inconsistance chez la souris ¹⁴ a été dans la pratique depuis les années 1960, par l' introduction d' une communauté définie de 8 espèces microbiennes dominantes souriceaux chaque nouvelle génération (modifié la flore SCHAEDLER),veiller à ce que chaque chiot est exposé aux mêmes membres clés de la microflore de la souris. Cette pratique contrôle de la composition du microbiote même lorsque le microbiote est pas la cible principale de l' étude ^32, et crée un précédent pour assurer la présence de microbes clés dans une variété de conditions expérimentales.

Pour définir l'influence des microbes sur la drosophile nutrition, plusieurs protocoles pour dériver des lignes de mouche axéniques ont été mis au point, y compris l' hypochlorite dechorionation d'embryons (soit dérivée de novo chaque génération ou maintenu generations par transfert à des régimes alimentaires stériles) et un traitement antibiotique ^13. Il y a des avantages à différentes approches, telles que la facilité et la rapidité à la fois du traitement aux antibiotiques et transfert en série, par rapport à un plus grand contrôle des variables confondantes avec de novo dechorionation (par exemple, la densité des oeufs, des microbes contaminants résiduels, les effets hors-cible d' antibiotiques). Indépendamment de la méthode dela préparation, l' introduction d'espèces microbiennes spécifiées aux axéniques embryons permet la culture de Drosophila avec les communautés ( 'gnotobiotiques') définis. Alternativement, imitant l'utilisation de la flore SCHAEDLER, cette communauté pourrait être inoculé aux œufs conventionnellement fixées (en suivant les étapes 6-7 seulement) pour assurer la présence de microbes de traits influençant dans chaque flacon et éviter les complications de microbiote inconsistance. Nous décrivons ici le protocole pour élever axénique et gnotobiotique Drosophila par de novo dechorionation d'embryons, et pour confirmer la présence de taxons microbien introduit ou contaminant.

Protocole

1. Les bactéries Culture (Début ~ 1 semaine avant cueillette des oeufs)

1. Préparer MRS modifié ²⁰ (TMM) plaques et tubes de bouillon (tableau 1). Verser 20 ml de gélose mmrs dans chaque plaque 100 mm de Pétri et laisser refroidir / sécher pendant la nuit, ou 5 ml mmrs bouillon dans 18 tubes à essai en mm.
2. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis et L. plantarum sur mmrs plaques d' agar. Incuber Acetobacter nuit à 30 ° C. Incuber dans des conditions anaérobies Lactobacillus en plaçant les plaques dans un récipient étanche à l' air et l' inondation avec du dioxyde de carbone avant le scellement. Incuber à 30 ° C pendant une nuit.
   Note: L. colonies brevis peuvent ne pas être visible jusqu'à 24-48 heures. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C et les colonies peuvent être utilisées pour 3 semaines.
3. Deux à trois jours avant de transférer les œufs dechorionated à l'alimentation stérile (section 5), choisir une seule colonie de la plaque de TMM dans un tube à essai conmmrs de Taining bouillon. Cultivez Acetobacter avec agitation et grandir Lactobacillus statiquement pendant 24 heures ou jusqu'à ce trouble, à la fois à 30 ° C.

2. Préparer stérile Diet

1. Préparer régime alimentaire stérile (tableau 2) dans un ballon Erlenmeyer de 2 litres. Micro-ondes le régime jusqu'à ce qu'il ait bouilli 3 fois séquentielles; mélanger entre chaque ébullition.
2. Placer le ballon sur une plaque d'agitation pour maintenir l'agitation tout en transférant l'alimentation à tubes à centrifuger coniques. Transfert de 7,5 ml de l'alimentation à tubes de 50 ml de centrifugeuse. plafonner légèrement les tubes, et le placer dans un rack de polypropylène autoclavable couverte.
3. Stériliser à l'alimentation de la mouche à l'aide d'un autoclave à 121 ° C et 15 psi pendant 25 min. Retirer les grilles de l'autoclave, et agiter immédiatement chaque rack horizontalement pour assurer l'alimentation ne se sépare pas pendant le refroidissement. Attention à ne pas secouer les grilles verticalement pour empêcher le transfert de l'alimentation sur le couvercle ou rebords des tubes. Laissez l'alimentation refroidir sur un agitateur pendant exactement 45 minutes etagiter de nouveau le régime à l'horizontale à la main.
   Note: Le régime alimentaire peut être conservé à 4-15 ° C pendant jusqu'à une semaine.
4. Comme une alternative à l'utilisation de racks autoclavables couverts (étapes 2.1-2.3), ou pour élever des mouches sur les régimes alimentaires contenant conservateur acide, procédez comme suit:
   1. Préparer 1 L diète liquide dans un flacon de 2 litres avec un barreau d'agitation dans le ballon. Autoclave le régime alimentaire.
   2. Après autoclavage, ajouter 10 ml de conservation et mélanger en continu sur une plaque d'agitation chauffée. Lorsque la gélose a refroidi à 50-60 ° C, déplacer le ballon à une plaque d'agitation chauffée dans une enceinte de sécurité biologique et de maintenir la température du flacon par chauffage à 50-60 ° C.
   3. Dans le cabinet de biosécurité, pipette ~ 7,5 ml individuellement dans des tubes coniques.

3. Préparer Cages pondeuses

1. Fabriquer des plaques d'agar-jus de raisin par micro-ondes 100 ml d'eau, de la levure de bière 10 g, 10 g de glucose et 1 g d'agar-agar. Porter à ébullition 3 fois à l'étape 1.1 et ajouter 10 g de raisins congelés jus concentrate pour augmenter la visibilité des oeufs sur la plaque de gélose.
2. Lors de l'agar a refroidi à 55 ° C, verser 20 ml dans des boîtes de Petri de 100 mm et laisser se solidifier.
3. Recouvrir la surface des plaques d'agar-agar avec une pâte de levure en mélangeant la levure de bière 1 g à 15 g d'eau. Verser la pâte de levure sur la plaque de gélose assurant que la surface est recouverte, puis verser l'excès, laissant un résidu de levure mince derrière. Si plusieurs plaques sont utilisées, la pâte peut être versé de manière séquentielle à plusieurs plaques.
4. Transférer des plaques d'agar dans le fond d'une cage.
   Remarque: Un conteneur de charcuterie 32 oz est un bon substitut pour les cages à mouches acryliques.
   1. Faire des couvercles pour conteneurs de charcuterie 32 oz en perçant un trou dans le haut et le collage d'une maille respirante sur le trou avec de la colle non toxique. Si la colle est soluble dans l'eau d'empêcher l'exposition de l'eau au couvercle.
5. Transfert 200-300 vole dans le récipient et le couvercle avec couvercle. Couvrez le trou de maille protégée avec une boîte de Pétri couvercle vide prévent l'évaporation de la surface de la gélose et ajouter un papier de soie humide à l'intérieur du couvercle, si désiré. Incuber mouches à 25 ° C pendant la nuit pour 16-20 h.

4. Recueillir des oeufs

1. Préparer un tamis pour la collecte des œufs en plaçant filet de nylon dans une douille en plastique.
2. Pour récupérer la plaque avec des oeufs sur elle, retirez les mouches de la cage en transférant à un conteneur vide. Si même les mouches seront utilisées le jour suivant, transférer immédiatement à une nouvelle cage contenant une plaque de gélose jus de raisin fraîchement yeasted. Les mouches peuvent être utilisées pendant 3-5 jours consécutifs
3. Retirer les mouches mortes de l'agar-agar avec un pinceau propre, en faisant attention de ne pas briser l'agar-agar.
4. Collecter des oeufs en rinçant la plaque de gélose avec de l'eau distillée, le brossage en douceur des œufs de la surface de la gélose, et en versant la suspension sur le maillage. Répéter 3-4 fois jusqu'à ce que la totalité ou la plupart des oeufs ont été enlevés de la plaque de gélose.

5. Dechorionate Oeufs et Transfert à Stérile Diet

1. Préparer l'enceinte de sécurité biologique par pulvérisation à l'intérieur (y compris les côtés) avec 70% d'éthanol. Essuyez le fond avec un tissu de laboratoire, et stériliser le capot avec une lumière UV pendant environ 15 min. Stériliser toutes les fournitures non-biologiques (spécimens tasses, pinceau, pinces, conteneurs de déchets, 400 ml d'eau stérilisée, et 100 ml d'hypochlorite de sodium à 0,6%) par pulvérisation avec de l'éthanol et de placer immédiatement dans l'armoire de biosécurité. Stériliser à la lumière UV pendant 15 min.
2. Commencez la première de 2 lavages d'hypochlorite de sodium en plaçant la douille avec les oeufs dans un ml spécimen tasse 120 ou un autre récipient stérile. ~ Verser lentement 90 ml d'une solution d'hypochlorite de sodium à 0,6% dans la douille jusqu'à ce que juste au-dessous de la jante.
3. Rincer les œufs pendant 2,5 minutes. Périodiquement remettre en suspension les oeufs à l'aide d'une pince pour déplacer la douille vers le haut et vers le bas dans la solution d'hypochlorite.
4. Transférer la douille directement dans une seconde tasse de spécimen, pré-rempli avec 90 ml eau de Javel, dans l'armoire de biosécurité.
5. Répéterl'étape 5.3 dans l'armoire de biosécurité. A la fin du deuxième traitement de blanchiment, les œufs devraient commencer à adhérer aux parois de la filière.
6. Effectuer les étapes 5.7-5.8 dans l'armoire de biosécurité.
7. Jeter l'eau de Javel et laver la douille avec de l'eau stérile 3 fois. Resuspendre les oeufs plusieurs fois au cours de chaque lavage par déplacement de la douille avec une pince. À la fin du troisième lavage la plupart des œufs doivent être fixés sur le côté de la douille.
8. Stérilisé à l'aide d'un pinceau dans l'éthanol, le transfert des œufs à partir du côté de la douille à l'alimentation stérile. Transfert des œufs individuellement ou en petits lots. Visez 30-50 œufs par flacon. Laissez les bouchons en vrac pour permettre à l'oxygène d'entrer dans le tube. Si les flacons doivent rester axénique, transfert à un incubateur d'insectes; sinon, ajouter des bactéries comme ci-dessous.

6. Faire Gnotobiotic Flies Utilisation de 4 espèces bactériennes

1. préparer des bactéries
   1. Préparer une enceinte de biosécurité stérilisée avec les fournitures nécessaires (pipettes, boîtes de pointes de pipettes, tubes à centrifuger stérilisés, bouillon de MRS et supports de tube à essai) comme à l'étape 4.1. Essuyez l'extérieur de tubes à essai avec un laboratoire d'éthanol imbibé lingette avant de placer dans l'armoire de biosécurité.
   2. Sédimenter les bactéries en transférant d'abord 500 pi de croissance pendant une nuit dans un tube de microcentrifugation stérile. Si la densité bactérienne est faible, ajouter jusqu'à 1,5 ml dans chaque tube ou séquentiellement retirer le surnageant et ajouter la culture supplémentaire dans le même tube. Retirer les échantillons de l'enceinte de sécurité biologique et centrifuger pendant 10 min à 10000 x g. Utilisez des conseils de filtre pour éviter la contamination entre les échantillons.
   3. Déterminer la densité de chaque culture par mesure de la DO _600. Si vous utilisez un lecteur de plaque multi-puits, transférer 200 ul de chaque culture à une plaque de 96 puits dans 1-, 2- et 4- dilutions.
   4. Déterminer la quantité de TMM dans lequel diluent chaque culot cellulaire (5.2.2) à l'aide d'un spectrophotomètre de lecture de plaque et les équations suivantes. Prévoyez d'ajouter assez de bouillon pour ensemencer 50 &# 956; l à chaque flacon de mouche.
      1. Collecter des lectures de DO à ₆₀₀ pour un rapport 1: 1, 1: 2 et 1: 4 dilutions de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre de plaque de lecture. Sélectionnez la dilution pour chaque souche bactérienne qui produit une valeur de ₆₀₀ OD entre 0,1 et 0,2 et utiliser cette valeur et son facteur de dilution correspondant comme «O» et «D» dans les formules données dans 6.1.4.2 ou 6.1.4.3.
      2. Si vous utilisez les 4 espèces décrites ici, normaliser les cellules à la colonie équivalente unité de formation (UFC) / ml densités (DO ₆₀₀ à la conversion CFU précédemment déterminé ²⁰⁾ en utilisant cette équation:
         E = ((OB) x V x D) / C
         où E = volume à remettre en suspension le culot dans (ul), O = OD ₆₀₀ bactéries, B = OD ₆₀₀ supports vierges, D = pli-dilution, V = culture bactérienne ul avant centrifugation, C = DO ₆₀₀ de constante prédéterminée. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations. Pour spectrophotomètres qu'automatiquement vide, utiliser "O" à la place de "OB".
         Remarque: Les constantes prédéterminées (unités DO _600, normalisée à 10 ⁷ ufc ml - ^1, les constantes dérivées en ²⁰⁾ sont les suivantes: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
      3. Si vous utilisez d' autres espèces bactériennes (pas CFU / OD ₆₀₀ constante est disponible), normaliser la densité de DO ₆₀₀ = 0,1 en utilisant cette équation:
         E = ((OB) x V x D) /0.1 OD ₆₀₀
         Note: Les unités sont les mêmes que dans l'étape 6.1.4.2. Voir code supplémentaire Fichier des exemples de calculs en utilisant ces équations.
   5. Dans le cabinet de biosécurité, retirer le surnageant avec une pipette et resuspendre le culot dans mmrs frais ou PBS tel que calculé à l'étape 6.1.4.2.
2. Inoculer bactéries
   1. Transférer 50 pl des bactéries aux tubes coniques avec une alimentation stériled dechorionated oeufs dans l'armoire de biosécurité. Ajouter des bactéries après le transfert d'oeufs pour éviter la contamination entre les flacons.
   2. Placer les tubes inoculés dans un incubateur à 25 ° C

7. Mesurer CFU Load / Test de Stérilité

1. Pour mesurer la charge CFU dans les homogénats entiers de mouche du corps, transfert 5 mouches (5-7 jours après Eclosion) à un tube de 1,7 ml de microcentrifugation contenant 125 pi de billes de céramique et 125 pi de bouillon TMM. Homogénéiser les mouches à l'aide d'un homogénéiseur tissulaire pendant 30 s à 4,0 m / s.
   1. Alternativement, omettent des perles et de la main homogénéisent dans des tubes à centrifuger avec pilons en plastique pour 1 min.
   2. Si la quantification du microbiote intestinal, surface stériliser les mouches pour éliminer les microbes exogènes ^22. Transfert vole à un tube de microcentrifugation contenant 100 ul de 70% d'éthanol pendant 1 min, aspirer l'éthanol, et le transfert à un nouveau tube pour homogénéisations. Si la teneur en ADN de l'intestin est mesurée, rincer fou 1 min avec de l'hypochlorite de sodium à 0,6% avant le lavage à l'éthanol.
2. Diluer le broyat avec 875 mmrs ul, vortex pendant 5 secondes, et pipeter 120 pi d'homogénat dans le premier puits d'une plaque de microtitrage.
3. Effectuer deux séquentielles 1: 8 dilutions en utilisant 10 homogénat pi et 70 pi de MRS dans les deux prochains puits.
   1. Retirer 10 ul du premier puits et l'ajouter à la deuxième puits contenant 70 ul MRS. Mélanger le contenu du deuxième puits à fond, le transfert de 10 ul du second puits au troisième puits contenant 70 ul MRS, et bien mélanger. Cela conduit à des 3 concentrations totales de l'homogénat initial 1000 pi: non dilué 1: 8 et 1:64.
4. Transfert de 10 pi de chaque dilution à une plaque mmrs (en utilisant une pipette à canaux multiples si désiré). Inclinez légèrement le plat pour répandre la dilution de plusieurs millimètres en bas de la surface de la gélose et permettre au liquide de sécher avant de déplacer la plaque. Le liquide sèche sur the plaque rapidement si les plaques sont âgés de 2 jours, ce qui réduit le mélange des deux gouttelettes voisines.
5. Incuber à 30 ° C pendant 1-2 jours. Retirer les plaques de l'incubateur, une fois distinctes, des colonies individuelles sont visibles, et compter à partir d'une dilution avec 10-100 colonies isolées.
6. Calculer CFU par volée en utilisant l'équation E = C x D / P x V / F, où E = CFU par mouche, C = nombre de colonies comptées, D = dilution, P = plaqué ul, V = volume de la mouche homogénat, et F = nombre de mouches homogénéisés.

Résultats

Élevage réussie de mouches axéniques est confirmé par l' isolement d'aucune CFU de homogénéisations corps entier de D. adultes melanogaster (Figure 1). Alternativement, si le broyat plaqué donne des colonies, les flacons sont contaminés et doivent être jetés. Pour les mouches gnotobiotiques, chacun des quatre isolats bactériens ont été isolés à partir de pools de 5 mâles adultes, ce qui démontre les différences de CFU viables t...

Discussion

La méthode décrite ici est l' une de plusieurs approches pour l' embryon dechorionation ^{8,11,18,25,26,27,} ainsi que d' autres méthodes d'élevage des mouches axéniques, y compris le transfert série des adultes axéniques ^18,27 ou un traitement antibiotique ^13,18. D' autres méthodes de dechorionation comprennent des lavages à l'éthanol et à réduire les ^11,25,26 ou étendent ⁸ traitement hypochlorite. Étapes de lavage différen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brewer's Yeast	MP Biomedicals, LLC.	903312	http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose	Sigma Aldrich	158968-3KG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar	Fisher--Lab Scientific	fly802010	https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate	Walmart or other grocery store	9116196	http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container	Webstaurant Store	999L5032Y	http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid	Webstaurant Store	999YNL500	http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles	Genesee Scientific	32-130	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs	Genesee Scientific	49-101	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh	Genesee Scientific	57-102	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing	Home Depot	100404002	http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Plastic Bushing Cap	Home Depot	100153897	http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897
Specimen Cup	MedSupply Partners	K01-207067	http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4	Eppendorf	4982000322	https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes	TrueLine Centrifuge Tubes	TR2003	https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes	USA Scientific	2316-5001	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk	MP Biomedicals, LLC.	116540434	http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300 μl	USA Scientific	1120-9810	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes	Laboratory Product Sales	M089303	https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol	Decon Laboratories, INC.	2701	http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush	Walmart	5133	http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps	Fisher	08-882	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite)	Walmart	550646751	http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone	Genesee Scientific	20-260	https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-500	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate	Sigma Aldrich	P3786-1KG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0&mode=match%20partialmax&lang= en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate	Sigma Aldrich	25102-500g	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0&mode=match%20partialmax&lang= en&region=US&focus=product
Sodium Acetate	VWR	97061-994	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M63-500	https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate	Sigma Aldrich	10034-96-5	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax&lang=en&region =US&focus=product
MRS Powder	Sigma Aldrich	69966-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader	BioTek (Epoch)	NA	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5500	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1,000 μl	USA Scientific	1122-1830	http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates	Greiner Bio-One	655101	https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/
Ceramic Beads	MP Biomedicals, LLC.	6540-434	http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer	MP Biomedicals, LLC.	116004500	http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet	Thermo Scientific	Model 1395	http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html