دراسة دور السنخية الضامة في سرطان الثدي ورم خبيث

Summary

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Abstract

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Introduction

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من مركز تكساس للتكنولوجيا جامعة العلوم الصحية وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" نشرت من قبل المعاهد الوطنية للصحة. استخدام ثمانية إلى اثني عشر الاسبوع القديمة الإناث الفئران BALB / ج المتوفرة تجاريا. حقن 1 × 10 ⁵ 4T1 أو 1 × 10 ⁵ 4T1 الخلايا معربا عن GFP، والتي يمكن شراؤها من مختلف البائعين، في لوحة الدهون الثديية.

1. ثقافة 4T1 و4T1-GFP الخلايا وإعداد ورم تعليق خلية لحقن ¹⁴

1. 4T1 و4T1-GFP خلية ثقافة
   ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.
   1. الحفاظ على 4T1 و4T1-GFP الخلايا في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100 U / البنسلين ملG و 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتوميسين.
      ملاحظة: تحديد عدد مرور عن طريق عد كل trypsinization والطلاء من الخلايا. من المهم أن استخدام الخلايا التي تحتوي على نفس العدد بمرور جميع التجارب الماوس، وعدد من الممرات يؤثر tumorigenicity الخلايا وإمكانية النقيلي.
   2. قبل حقن الخلايا إزالة T75 سم ² قارورة تحتوي على الخلايا السرطانية بنسبة 80٪ confluency، من وسيلة الحاضنة ونضح. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وتدوير القارورة بلطف لتغسل ما تبقى متوسطة، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
   3. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين مع EDTA إلى القارورة والميل إلى توزيع حل موحد على السطح واحتضان في حاضنة مرطب لمدة 3 دقائق في 37 مئوية مع 5٪ CO _2.
   4. اضغط على قارورة لتسهيل مفرزة من الخلايا وإضافة 8 مل من المتوسط ​​الطازجة. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة.
   5. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. في 500 x ج في RT.نضح طاف وغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
   6. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. أخذ 100 ميكرولتر من تعليق خلية وعدد الخلايا باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
   7. حساب عدد الخلايا المطلوبة لجميع الحقن باستخدام صيغة: 10 ⁵ خلايا لكل الماوس س # الفئران المستخدمة في تجربة (دائما إعداد الخلايا الإضافية لتكون على الجانب الآمن).
   8. خلايا الطرد المركزي كما هو الحال في 1.1.5. إزالة طاف من خلال الطموح و resuspend الخلايا في كمية من برنامج تلفزيوني جديد المطلوبة للحصول على تركيز خلية النهائي من 1 × 10 ⁶ خلية / مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى جاهزة للحقن.
2. 4T1 أو 4T1-GFP خلية إجراءات حقن الفأر
   1. قبل يوم واحد حقن الخلايا السرطانية، تخدير الفئران في غرفة الاستقراء مع 3٪ الأيزوفلورين. مرة واحدة الفئران هي نائمة وتتنفس بانتظام، مكان رانه الماوس على وسادة الجراحية مع الأنف داخل مخروط الأنف، وذلك لربط المرذاذ الأيزوفلورين. الحفاظ على التخدير مع 2.5٪ الأيزوفلورين. قرصة اصبع القدم الماوس للتأكد من أن الفأر هو تخدير.
   2. تطبيق كريم إزالة الشعر باستخدام قطعة من القطن لموقع الحقن (الحق الصدرية الثدي وسادة دهنية) والانتظار لمدة 2 دقيقة. تنظيف الموقع باستخدام منشفة ورقية مبللة، ضع الماوس مرة أخرى في قفص ومراقبة حيوان حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
   3. في يوم من الحقن، وتخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.2 ووضع على لوحة العمليات الجراحية.
   4. دوامة أنبوب يحتوي على الخلايا السرطانية للحصول على تعليق خلية موحد. نضح 100 ميكرولتر من تعليق خلية، التي تحتوي على 1 × 10 ⁵ الخلايا السرطانية، إلى حقنة الأنسولين 0.5 مل (29 G، 12.7 ملم طول إبرة).
   5. رفع الجلد باستخدام مؤشر الإبهام والإصبع بالقرب من ^{الثانية} 2 و 3 ^{الثالثة} الحلمة، إدراج إبرة الحقنة في معمر الذي كان ينتظرذ منصة الدهون أسفل الحلمة الثالثة تحت الجلد بين الأصابع وحقن الخلايا ببطء لتشكيل فقاعة (حقن تحت الجلد).
   6. ضع الماوس مرة أخرى في قفص بعد الحقن ومراقبة كما هو الحال في 1.2.2.
3. نمو الأورام المراقبة
   1. القياسات الفرجار ¹⁴
      ملاحظة: المصبوبة 4T1 أو 4T1-GFP الخلايا تشكل العدوانية ورم الثدي. وعادة ما تظهر الأورام واضح ~ في يوم 4-5 بعد التلقيح الخلية. خلايا 4T1-GFP تشكل الأورام التي تنمو أبطأ وإعطاء الانبثاث في وقت لاحق. قياس الورم مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. إذا الحالة السريرية للحيوانات تدهور والحيوانات تفقد أكثر من 10٪ من وزن الجسم، والأورام تتجاوز 10٪ من وزن الجسم، أو أن تصبح متقرحة، الموت ببطء الفئران على الفور.
      1. تخدير الفأر كما هو الحال في 1.2.1.، وزن، وضعها على لوحة الجراحية والرطب المنطقة مع 70٪ من الإيثانول.
      2. جس الورم في موقع الحقن (4 - 5 أيام بعد التلقيح الخلية).
      <لى> قياس أكبر قطر (D) وأصغر قطره (D1) مع الفرجار.
      3. حساب حجم الورم باستخدام الصيغة حجم = (DX D1 X D1) / 2 مم ^3. رصد الانتعاش الماوس من التخدير كما هو الحال في 1.2.2.
   2. التصوير (فقط لل4T1 الخلايا GFP)
      1. تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ضع الماوس على مرحلة المنقولة داخل الصك التصوير. الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف.
      2. تشغيل أداة التصوير ومصدر الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. تحت عنوان "شراء" علامة التبويب انتقل إلى "الإضاءة" والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. تأكد من أن المحرك الضوء على واختر "ترانس" في جدول خفيف.
      4. تحت علامة التبويب "مجهر"، حدد "مسح" تصفية الانبعاثات و0.5X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4".
      5. انقر على معاينة لتحديد موقع الورم في الضوء الأبيض، والتركيز للحصول على صورة واضحة، وانقر القبض عليه.
      6. انتقل إلى "شراء" علامة التبويب وتغيير الإضاءة لتصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
      7. تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب (الشكل 1).

2. إدارة الطريق الأنفي من الليبوزومات ¹⁰

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. في يوم 6 بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.1.
2. دوامة clodronate أو التحكم (PBS) الحويصلية تعليق تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. يستغرق 60 ميكرولتر الحويصلية الصورةuspension باستخدام معقم طرف ماصة.
3. ببطء الافراج عن حل الحويصلية (5 ميكرولتر في كل مرة) بالقرب من الخياشيم مما يسمح الماوس للتنفس في الحل، كرر حتى يدار جرعة كاملة من 60 ميكرولتر.
4. دع الماوس يستعيد وعيه قبل وضعه مرة أخرى في قفص.
5. إدارة الحويصلية كرر وضحى كل 3 أيام حتى الفئران. لا إدارة الجسيمات الشحمية في يوم النحر.

3. التضحية ماوس ومجموعة الأنسجة

ملاحظة: استخدام تعقيمها وأدوات معقمة للتشريح الفأر. الموت ببطء الفئران وتحت التخدير عن طريق استنزاف وإزالة الأعضاء الحيوية.

1. في يوم 22 (ل4T1 الخلايا) أو يوم 26 (للخلايا 4T1-GFP) بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ووضع على لوحة الجراحية مع مخروط الأنف متصلة المرذاذ، والحفاظ على التخدير كما هو الحال في 1.2.1. قرصة واحدة من أصابع القدم للتأكد من أن م[أوس] فاقد الوعي.
2. دبوس أصابع باستخدام الإبر إلى لوحة تشريح. رذاذ الايثانول على الجلد الماوس.
3. رفع الجلد باستخدام ملقط وجعل شق مع مقص جراحي. ببطء فضح الصفاق ومواصلة قطع الجلد من خلال القفص الصدري حتى الرقبة.
4. باستخدام مقص جراحي إجراء شق في الغشاء البريتوني وفضح بعناية الأجهزة مع نصائح القطن تجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية.
5. نقل الأجهزة إلى جانب واحد وفضح الوريد الأجوف السفلي. ثقب الوريد وجمع الدم مع حقنة الانسولين 29 G. وضع الدم التي تم جمعها في أنبوب وترك على الجليد لمزيد من المعالجة.
6. قطع الحجاب الحاجز لفضح القفص الصدري والرئتين والقلب. خفض ببطء القفص الصدري على كلا الجانبين باستخدام قطع العظام ورفع الجزء العلوي من القفص الصدري. الاستيلاء على القلب مع ملقط وقطع النسيج الضام الذي يربط بين القلب والرئتين إلى تجويف الصدر.
7. وضع الرئتين في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني في 60 ملمطبق بتري على الجليد حتى جاهزة للتصوير ومزيد من المعالجة لأقسام المجمدة للفحص المجهري مناعي أو الأنسجة الروتينية [بما في ذلك الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ].

4. الانبثاث تقييم الرئة

1. عد وتسجيل النقاط الانبثاث السطحية
   1. وضع طبق بتري مع الرئتين تحت المجهر تشريح. التركيز على الحصول على رؤية واضحة للسطح الرئة.
   2. باستخدام مجهر تشريح مراقبة سطح الرئة. عدد الانبثاث على الأمامي والخلفي الجانبين من كلا الرئتين.
      ملاحظة: إن رئة طبيعية مبيضة أو وردي والتي يسهل اختراقها ولها اسفنجة مثل هيكل. الانبثاث 4T1 صلبة وغير مسامية، يبدو في بعض الأحيان أن تكون مماثلة لقطرة من السائل (الشكل 2A).
2. تصوير الرئة
   1. وضع طبق بتري مع الرئتين على المسرح المنقولة داخل الصك التصوير.
   2. بدوره على الصك وبيولايت مصدر متعدد الأطياف. فتح البرنامج. تحت علامة التبويب "الاستحواذ"، انتقل إلى "الإضاءة"، والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. محرك خفيف -> ON، الجدول ضوء -> برنامج التحصين الموسع. تحت "مجهر" التبويب اختر 'مسح' تصفية الانبعاثات و1.66X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4".
   3. انقر على معاينة والتركيز للحصول على صورة واضحة من الرئتين في الضوء الأبيض وانقر القبض عليه.
   4. انتقل إلى "شراء" علامة التبويب والتغيير إلى تصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
   5. تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب.
   6. الوجه الرئتين للحصول على صورة من الجانب الآخر بنفس الطريقة. هذا بروكedure يولد صورا لالانبثاث-GFP الإيجابي الذي يمكن زيادة كميا باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 2B) ^14.
3. مناعي المجهر
   1. إصلاح الرئتين في 4٪ امتصاص العرق، في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في الظلام.
   2. يغسل النسيج مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لإزالة تثبيتي. نقل إلى 18٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
   3. إزالة الأنسجة من السكروز وربت من أي فائض.
   4. اتخاذ cryomold، وتغطي الطبقة السفلية مع أكتوبر المتوسطة. وضع الأنسجة في أكتوبر المتوسطة. ملء القالب مع أكتوبر المتوسطة لتغطية كامل الأنسجة ومكان على الثلج الجاف.
   5. كتلة مخزن في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
   6. إعداد 5 ميكرون أبواب سميكة مع ناظم البرد ومكان على الشرائح المشحونة.
   7. تخزين الشرائح غير المستخدمة في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
   8. الهواء الجاف الشرائح لمدة 7 دقائق. ويغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر WIPالبريد الشريحة مع نسيج أو منشفة ورقية لإزالة فائض من المياه، جبل زلات غطاء مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي وتصور مع مرشح GFP تحت المجهر.
   9. تحديد الانبثاث GFP (الشكل 3A) باستخدام البرنامج المناسب ^(14).
4. علم الأنسجة وعلم الأمراض الرقمية
   1. انقر على زر تحميل يدوية تحت علامة التبويب البداية وانتظر الشريحة عقد رف لإخراج من الماسح الضوئي.
   2. خذ قسم الأنسجة H & E الملون، وتنظيفه مع النسيج لإزالة أية أوساخ، ووضعه بشكل آمن في رف الشريحة القابضة.
   3. أدخل وصف الشرائح في الإطار برزت المتابعة.
   4. حدد علامة التبويب مسح المنطقة على إطار وحدة التحكم SS التصوير وضبط الساحة الخضراء لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي يتم مسحها ضوئيا.
   5. اسحب معايرة الماس الأزرق لجزء واضح من الشريحة، حيث الأنسجة غير موجودة، ومع ذلك، في العائد على الاستثمار.
   6. بعد ذلك، حدد التركيز Points التبويب وانقر على زر لصناعة السيارات حدد للحصول على عدة نقاط التركيز (علامة زائد الصفراء) على الأنسجة في العائد على الاستثمار.
   7. إذا لزم الأمر، ضع نقطة التركيز إضافية يدويا عن طريق النقر المزدوج في العائد على الاستثمار.
   8. انتقل إلى علامة التبويب معايرة وحدد زر معايرة لبدء المعايرة الشرائح عند نقطة المعايرة الماس الأزرق. وبعد الانتهاء من معايرة يتم عرض صورة من وجهة المعايرة.
   9. تفقد هذه الصورة لضمان أن تكون واضحة وخالية من الأوساخ أو التحف.
   10. انتقل إلى علامة التبويب مسح ضوئي واختر بدء المسح الضوئي لبدء المسح الضوئي من العائد على الاستثمار. يتم تحويل قسم النسيجي الممسوحة ضوئيا إلى شريحة رقمية (الشكل 3B و 4A)
   11. قياس العبء المنتشر كما هو موضح سابقا (الشكل 4B) ^14.

5. التدفق الخلوي (FACS) تحليل السنخية الضامة في الرئتين

1. إعداد أنظمة التعليق خلية واحدةعلى
   1. بعد التصوير والعد الانبثاث، وغسل الرئتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ووضع على طبق بيتري. جعل 1 - 2 قطعة ملم من الرئتين باستخدام مقص جراحي وملقط.
   2. ونقل القطع الرئة إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 3 مل من العازلة الهضم تحتوي على 1 ملغ / مل كولاجيناز P، 0.04mg / مل الدناز الأول، و 10 ميكروغرام / مل مثبط التربسين حل المتوسطة RPMI (عقيمة).
   3. احتضان أنبوب مخروطي على شاكر الدورية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
   4. إزالة المخروطية أنبوب من الحاضنة وماصة الحل صعودا وهبوطا لفصل الأنسجة.
   5. تمرير حل من خلال مصفاة 40 ميكرون لتجنب كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. إذا لزم الأمر، لتتفكك أفضل للهضم أنسجة الصحافة الأنسجة ضد مصفاة الخلية بمساعدة الغواص حقنة.
   6. عندما تم التوصل إلى تعليق خلية واحدة، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وليز خلايا الدم الحمراء مع2 مل من العازلة ACK لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، ويغسل بيليه مرتين في 8 مل من RPMI.
   7. خلايا Resuspend في 3 مل من المتوسط ​​RPMI الكامل والمضي قدما إلى الخلية عد باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
2. تلطيخ للخلايا الرئة لعلامات السطحية
   ملاحظة: تنفيذ جميع حضانات في 4 درجات مئوية. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج و 4 درجات مئوية.
   1. ماصة 1 × 10 ⁶ خلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS (1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا-V السفلي. باستخدام 96 لوحة جيدا-V أسفل يسهل تسليم عينات متعددة.
   2. قبل احتضان تعليق الخلية مع 1 ميكروغرام ماوس التيسير كتلة تنقية مكافحة فأر CD16 / CD32 في 100 ميكرولتر من FACS العازلة لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي ال 96 لوحة جيدا-V السفلي لتكوير الخلايا وإزالة طاف بواسطة التقليب لوحة والسماح للاستنزاف حل.
   3. لتلطيخ السطح، مقدما، يخفف من الأجسام المضادة لmurinمستضدات الإلكترونية في أنبوب واحد (مزيج الرئيسي): BV605 CD45 (30 F11)، والمؤسسة العامة CD11b (M1 / 70)، والمؤسسة العامة / Cy7 F4 / 80 (BM8)، APC / Cy7 CD11c و(N418)، PerCPCy5.5 أنا ^A / أنا ^E (MHCII) (M5 / 114،152)، والمؤسسة العامة CD80 (16-10A1)، AF 647 CD86 (GL-1) إلى التركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل في المخزن FACS تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من التيسير كتلة CD16 / CD32 الأجسام المضادة.
      ملاحظة: هذه مجموعة من الأجسام المضادة هو مفيد لتحديد وتقييم والحالة الوظيفية للالضامة السنخية والخلايا الجذعية.
   4. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف (مزيج الرئيسي) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا-V القاع واحتضان عند 4 مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي في 500 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
   6. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإضافة صبغة الجدوى مخففة في برنامج تلفزيوني (1: 1000). احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 ج.
   7. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. يغسل مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لوحة مرة أخرى.
   8. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 1٪ امتصاص العرق وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى اكتساب أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية. قبل تعليق خلية نقل الاستحواذ على أنابيب البولي بروبلين نظام مراقبة الأصول الميدانية.

6. تحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية: استراتيجيات المحاصرة وتحديد الفئات السكانية خلية

1. لتحليل FACS كما ذكرت سابقا ^10. حصلت بوابة خلية / الأحداث على أساس forward- (FSC) والجانب مبعثر (SSC)؛ ثم بوابة الحية وCD45 ⁺ الخلايا. لتحديد بلعم السنخية، بوابة CD11b سلبية ومن ثم الخلايا CD11c ^و+ F4 / 80 ^+. (الشكل 5A).

النتائج

حقن الخلايا السرطانية 4T1-GFP في لوحة الدهون الثديية يؤدي إلى تكوين أورام الماوس (الشكل 1A) أن ألخص انتشار النقيلي سرطان الثدي البشري، كما تتشكل الانبثاث بسرعة في الرئتين (الشكل 2)، والكبد والعظام ودماغ الفئران ^11. ترنسفكأيشن مستق...

Discussion

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP