לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

Summary

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Abstract

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Introduction

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protocol

כל במחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של מרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת טקסס טק ועקב אחר ההנחיות המתוארות בסעיף "מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. השתמש שמונה עד תריסר בשבוע עכברי BALB נקבה בת / ג כי הם זמינים מסחריים. להזריק 1 x 10 ⁵ 4T1 או 1 x 10 ⁵ 4T1 תאים להביע GFP, אשר ניתן לרכוש מיצרנים שונים, לתוך כרית שומן החלב.

1. תרבות של 4T1 ו 4T1-GFP תאים & הכנת תרחיף תא גידול עבור זריקות ¹⁴

1. 4T1 ו 4T1-GFP תרבית תאים
   הערה: בצע את כל השלבים באמצעות פתרונות סטריליים זרימת אוויר למינרית (LAF) קבינט ביו בטיחות אלא אם צוין אחרת.
   1. שמרו על תאי 4T1 ו 4T1-GFP במדיום RPMI בתוספת 10% עוברי שור סרום מומת חום 100 U / ml פניציליןG ו- 100 מיקרוגרם / סולפט סטרפטומיצין מ"ל.
      הערה: בדוק מספר מעבר על ידי ספירת כל trypsinization ו ציפוי של תאים. חשוב להשתמש בתאים עם אותו המספר מעבר לכל ניסויי העכבר, ככל שמספר קטעים משפיעים tumorigenicity תא פוטנציאל גרורתי.
   2. לפני זריקות תא להסיר את הבקבוק T75 ² ס"מ, המכיל תאים סרטניים ב 80% confluency, מן מדיום החממה לשאוב. הוסף 10 מ"ל של PBS וסובב את הבקבוק בעדינות כדי לשטוף את המדיום הנותרים, ולאחר מכן לשאוב PBS.
   3. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% עם EDTA אל הבקבוק להטות אותו להפיץ את פתרון אחיד על פני השטח דגירה חממה humidified במשך 3 דקות ב 37 C עם 5% CO _2.
   4. הקש על הבקבוק כדי להקל ניתוק של תאים ולהוסיף 8 מ"ל של מדיום חדש. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבש גושים ולקבל השעית תא בודדת.
   5. תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות. ב XG 500 ב RT.לשאוב את supernatant ולשטוף תאים 10 מ"ל של PBS.
   6. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבש גושים ולקבל השעית תא בודדת. קח 100 μl של השעיה תא ולספור את התאים באמצעות מנתח כדאיות התא לפי הוראות היצרן.
   7. חישוב מספר התאים הנדרשים עבור כל הזריקות באמצעות נוסחא: 10 ⁵ תאים לכל עכבר x # של עכברים המשמשים בניסוי (תמיד להכין תאים עודפים כדי להיות על צד בטוח).
   8. צנטריפוגה תאים כמו 1.1.5. הסר את supernatant באמצעות תאי שאיפה גלולים בסך של PBS הטרי נדרש לקבל ריכוז תא סופי של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. שמור על השעיית התא על קרח עד מוכן להזרקה.
2. נהלי תא הזרקה ועכבר 4T1 או 4T1-GFP
   1. היום לפני הזרקת תאים סרטניים, להרדים עכברים בתא אינדוקציה עם 3% isoflurane. לאחר עכברים ישנים ונושם באופן קבוע, במקום tהוא העכבר על כרית כירורגית עם האף בתוך חרטומו, ולחבר אותו מאדה isoflurane. לשמור על הרדמה עם 2.5% isoflurane. לצבוט את הבוהן העכבר על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדם.
   2. החל שיער קרם להסרה באמצעות מקלון צמר גפן על הזריקה (כרית שומן חלב חזה מימין) ומתן 2 דקות. נקה את האתר בעזרת מגבת נייר רטובה, הצב את העכבר בחזרה אל תוך הכלוב לפקח חיה עד להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal.
   3. ביום הזרקה, להרדים את העכברים כמו 1.2.2 ומניחים על הכרית כירורגית.
   4. וורטקס הצינור המכיל תאים סרטניים לקבל השעית תא אחידה. לשאוב 100 μl של השעיה תא, המכיל 1 x 10 ⁵ תאים סרטניים, לתוך מזרק אינסולין 0.5 מ"ל (29 G, 12.7 אורך מחט מ"מ).
   5. הרם את העור באמצעות האינדקס האגודל והאצבע ליד הפטמה 2 ^nd ו -3 ^rd, להכניס את המחט של המזרק לתוך mammary שומן כרית מתחת לפטמה השלישית מתחת לעור בין האצבעות להזריק תאי לאטו לכדי בועה (הזרקה תת עורית).
   6. מניחים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב לאחר ההזרקה ולפקח כמו 1.2.2.
3. צמיחת גידול ניטור
   1. מדידות Caliper ¹⁴
      הערה: מוזרק 4T1 או תאי 4T1-GFP יוצרים גידול בשד אגרסיבי. בדרך כלל גידולים המוחשיים להופיע ~ ביום 4 - 5 לאחר חיסון תא. תאי 4T1-GFP יוצרים גידולים הגדלים לאט ולתת גרורות מאוחר יותר. מדוד את הגידול פעם עד שלוש פעמים בשבוע. אם המצב הקליני של חיות מידרדר, חיות לאבד יותר מ -10% ממשקל הגוף, גידולים יעלה על 10% ממשקל הגוף או להיות כיבים, להרדים עכברים מיד.
      1. להרדים עכבר כמו 1.2.1., לשקול, מקום על הכרית כירורגית להרטיב את האזור עם אתנול 70%.
      2. למשש גידולים באתר ההזרקה (4 - 5 ימים לאחר חיסון התא).
      3. מדוד את הקוטר הגדול (D) בקוטר קטן (ד 1) עם קליפר.
      4. חישוב נפח הגידול באמצעות נוסחה נפח = (DX D1 X ד 1) / 2 מ"מ ^3. צג התאוששות עכבר מן ההרדמה כמו 1.2.2.
   2. הדמיה (רק עבור 4T1 תאים GFP)
      1. להרדים את העכבר כמו 1.2.1. מניח את העכבר על במת מטלטלין בתוך מכשיר ההדמיה. לשמור על הרדמה באמצעות חרטומו.
      2. הפעל את מכשיר ההדמיה מקור האור לפי הוראות היצרן.
      3. בכרטיסייה "הרכישה" ללכת "תאורה" ולעבור למצב הריק (ללא מסנן) עבור אור לבן. ודא כי מנוע הנורית דולק ובחר 'חוצה' בטבלת האור.
      4. בכרטיסייה "מיקרוסקופ", בחר "נקה" מסנן פליטה וגדלת 0.5x. בלשונית "מצלמה", לוודא כי binning עבור לכידת הוא '1 x 1' תצוגה מקדימה '4 x 4 ".
      5. לחץ על תצוגה מקדימה כדי לאתר את הגידול ב אור לבן, להתמקד כדי לקבל תמונה ברורה, ולחץ ללכוד.
      6. עבור אל הכרטיסייה תאורה ושינוי "רכישה" כדי לסנן 1 (מסנן עבור GFP לפי הוראה של היצרן). בלשונית "מיקרוסקופ", לשנות מסנן פליטה כדי "530/20 GF". תצוגה מקדימה לכידת תמונה בתוך ערוץ ירוק. התאם זמן חשיפה כדי לקבל את הבהירות המתאימה.
      7. החל pseudocolor אל התמונה ולשמור בתיקייה מתאימה (איור 1).

2. מינהל אפי של ליפוזומים ¹⁰

הערה: בצע את כל השלבים באמצעות פתרונות סטריליים זרימת אוויר למינרית (LAF) קבינט ביו-בטיחות אלא אם צוין אחרת.

1. ביום 6 לאחר הזרקת תאים סרטניים להרדים עכברים כמו 1.2.1.
2. וורטקס ההשעיה clodronate או שליטה (PBS) ליפוזום השיג מהיצרן. קח 60 μl ליפוזום suspension באמצעות קצה פיפטה סטרילית.
3. לאט לשחרר פתרון liposome (5 μl בכל פעם) ליד הנחיריים המאפשרים בעכבר כדי לנשום הפתרון, לחזור עד המנה כולה של 60 μl מנוהלת.
4. בואו העכבר להכרתו לפני הצבת אותו בחזרה בכלוב.
5. ממשל ליפוזום חזור כל 3 ימים עד העכברים מוקרבים. אין לנהל ליפוזומים ביום של הקרבה.

3. קורבן עכבר אוסף רקמות

הערה: השתמש autoclaved ומכשירים סטרילי לנתיחת עכבר. להרדים עכברים לאחר הרדמה דרך exsanguination והסרה של איברים חיוניים.

1. ביום 22 (עבור 4T1 תאים) או יום 26 (עבור 4T1-GFP תאים) לאחר ההזרקה תאים סרטניים להרדים את העכבר כמו 1.2.1. ומניחים על כרית כירורגית עם חרטומו מחובר מאדה, לשמור על הרדמה כמו 1.2.1. קמצוץ אחד של בהונות כדי להבטיח כי מ 'על יד הבית הוא מחוסר הכרה.
2. הצמד את האצבעות באמצעות מחטים אל קרש החיתוך. תרסיס אתנול על עור העכבר.
3. הרם את העור באמצעות מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים כירורגיות. לאט לחשוף את הצפק ולהמשיך חיתוך העור דרך בית החזה עד הצוואר.
4. בעזרת מספריים כירורגיות עושים חתך הצפק ולחשוף בעיון את האיברים עם טיפים כותנה הימנעות לנזק בכלי הדם.
5. הזז את האיברים לצד אחד ולחשוף את הווריד הנבוב הנח. לנקב את הווריד לאסוף דם עם מזרק אינסולין 29 G. מניח דם שנאסף לתוך הצינור ולהשאיר על קרח לעיבוד נוסף.
6. חותכים את הסרעפת לחשוף את כלוב הצלעות, הריאות והלב. לאט לחתוך את כלוב הצלעות משני הצדדים באמצעות חותך העצם להרים את החלק העליון של בית החזה. תפוס את הלב עם מלקחיים ולחתוך רקמת חיבור חיבור ללב ולריאות אל חלל החזה.
7. מניחים את הריאות ב כמות קטנה של PBS ב -60 מ"מצלחת פטרי על הקרח עד מוכן הדמיה ועיבוד נוסף סעיפים קפוא עבור מיקרוסקופיה immunofluorescent או היסטולוגיה שגרתית [כולל hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים].

4. הערכה גרור ריאות

1. ספירת וניקוד גרורות Surface
   1. מניחים את צלחת פטרי עם הריאות תחת מיקרוסקופ לנתיחה. פוקוס כדי לקבל תצוגה ברורה של פני שטח הריאות.
   2. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה להתבונן שטח הריאות. רוזן גרור בצידי הקדמי וגם האחורי של שני הריאות.
      הערה: ריאות נורמלי הוא לבנבן או ורדרד ונקבובי ובעל ספוג כמו מבנה. גרורות 4T1 הן מוצקות נקבוביות, לפעמים להיראות דומה טיפת הנוזל (איור 2 א).
2. הדמית ריאות
   1. מניח את צלחת פטרי עם ריאות על במת המטלטלין בתוך מכשיר ההדמיה.
   2. הפעל את המכשיר ואתbiolite מקור multispectral. פתח את התוכנה. בכרטיסייה, "רכישה", ללכת "תאורה", ולעבור למצב ריק (ללא מסנן) עבור אור לבן. מנוע אור -> ON, שולחן אור -> Epi. בכרטיסייה "מיקרוסקופ" בחר מסנן פליטה 'נקה' וגדלת 1.66X. בלשונית "מצלמה", לוודא כי binning עבור לכידת הוא '1 x 1' תצוגה מקדימה '4 x 4 ".
   3. לחץ על תצוגה מקדימה להתמקד כדי לקבל תמונה ברורה של ריאות ב אור לבן ולחץ ללכוד.
   4. יש להקליק על "רכישה" כרטיסייה ושינוי לפילטר 1 (המסנן עבור GFP לפי ההוראה של היצרן). בלשונית "מיקרוסקופ", לשנות מסנן פליטה כדי "530/20 GF". תצוגה מקדימה לכידת תמונה בתוך ערוץ ירוק. התאם זמן חשיפה כדי לקבל את הבהירות המתאימה.
   5. החל pseudocolor לתמונה ולשמור התיקיה המתאימה.
   6. תהפוך את הריאות כדי לקבל תמונה של הצד השני באופן דומה. proc זהedure מייצר תמונות של גרורות GFP חיובי כי ניתן לכמת עוד באמצעות תוכנה מתאימה (איור 2 ב) ^14.
3. מיקרוסקופי Immunofluorescent
   1. תקן את הריאות paraformaldehyde 4%, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות בחושך.
   2. פעמיים לשטוף את הרקמה עם 10 מ"ל PBS במשך 5 דקות כדי להסיר את מקבע לחלוטין. העבר ל -18% סוכרוז PBS דגירה O / N ב 4 ° C.
   3. הסרת הרקמה מן סוכרוז להספיג את כל עודף.
   4. קח cryomold, לכסות את השכבה התחתונה עם מדיום OCT. הנח את הרקמה על מדיום OCT. ממלא את התבנית עם מדיום אוקטובר כדי לכסות לחלוטין את הרקמה ומניח על קרח יבש.
   5. בלוק חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד חתך.
   6. כן 5 מיקרומטר חלקים עבים עם cryostat ומניח על שקופיות טעונות.
   7. אחסן שקופיות בשימוש ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
   8. האוויר יבש שקופית עבור 7 דקות. ולשטוף עם PBS להסיר OCT. WIPדואר השקופית עם מגבת רקמה או נייר כדי להסיר עודפי מים, הר תלושי לכסות עם הרכבה בינונית המכיל DAPI ולדמיין עם מסנן GFP תחת מיקרוסקופ.
   9. לכמת גרורות GFP (איור 3 א) עם השימוש של תוכנה מתאימה ^14.
4. היסטולוגיה ופתולוגיה הדיגיטלי
   1. לחץ על כפתור Load הידני תחת הלשונית התחל ומתן השקופית מחזיקה מתל להוציא מהסורק.
   2. קח את סעיף רקמה צבעונית H & E, לנקות אותו עם רקמות כדי להסיר לכלוך, ולמקם אותו בבטחה מדף ועליו שקופית.
   3. הזן את תיאור שקופיות בחלון צץ-אפ.
   4. בחר בכרטיסיית שטח הסריקה על חלון מסוף הדמית SS ולהתאים את הריבוע הירוק להגדיר באזור (ROI) ריבית לסריקה.
   5. גרור את יהלומי כיול הכחולים לחלק ברור של השקופית, שבו הרקמה נעדרת, עם זאת, בתוך ROI.
   6. הבא, בחר את הפוקוס Pכרטיסיית oints ולוחץ על לחצן בחירה האוטומטי להשיג נקודות פוקוס מספר (סימני חיבור צהובים) על רקמת ההחזר על ההשקעה.
   7. במידת הצורך, למקם נקודות פוקוס נוספות באופן ידני על ידי לחיצה כפולה בתוך ROI.
   8. המשך אל כרטיסיית הכיול ובחר את כפתור הכיול להתחיל כיול שקופיות בנקודת יהלום כיול הכחולה. לאחר הכיול הושלם התמונה מנקודת הכיול יוצג.
   9. בדוק את התמונה על מנת להבטיח כי ברור ללא לכלוך או חפצים.
   10. המשך אל הכרטיסייה Scan ובחר התחל סריקה כדי להתחיל בסריקה של ROI. סעיף היסטולוגית סרוק מומר שקופית דיגיטלית (איור 3B ו 4A)
   11. לכמת נטל גרורתי כפי שתואר לעיל (איור 4B) ^14.

5. Cytometry זרימה (FACS) ניתוח של מקרופאגים מכתשיים בריאות

1. הכנת Suspensi תא יחידעַל
   1. לאחר הדמיה ועוד היד נטויה של גרורות, לשטוף את הריאות עם PBS סטרילית ומניחים על צלחת פטרי. הפוך 1 - 2 חתיכות מ"מ של הריאות באמצעות מספריים כירורגיים מלקחיים.
   2. מעבירים את חתיכות ריאות אל צינור חרוטי 15 מ"ל עם 3 מ"ל של חיץ העיכול המכיל 1 מ"ג / P collagenase מ"ל, 0.04mg / ml DNase אני, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מעכב טריפסין בינוני RPMI מומס (סטרילי).
   3. דגירת צינור החרוטים על שייקר מסתובב בחממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
   4. הסר את חרוטי צינור מן החממה פיפטה הפתרון מעלה ומטה כדי לנתק את הרקמה.
   5. להעביר את הפתרון דרך מסנן 40 מיקרומטר, כדי למנוע גושים ולקבל השעית תא בודדת. במידת הצורך, כדי לפורר את מתעכלות רקמות עיתונות רקמות נגד מסננת התא בעזרת מזרק בוכנה טובות יותר.
   6. כאשר השעית תא בודדת הושגה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו lyse כדורי דם אדום עם2 מ"ל של חיץ ACK עבור 10 דקות ב RT. לאחר מכן, לשטוף גלולה פעמיים ב 8 מ"ל של RPMI.
   7. תאים Resuspend ב 3 מ"ל של המדיום RPMI להשלים ולהמשיך התא לספור באמצעות מנתח כדאיות התא לפי הוראות היצרן.
2. צביעת תאי ריאות עבור סמני משטח
   הערה: בצע את כל incubations על 4 מעלות צלזיוס. צלחת צנטריפוגה XG ב 500 ו -4 מעלות צלזיוס.
   1. פיפטה 1 x 10 ⁶ תאים 100 μl של חיץ FACS (FBS 1% ב PBS) בארות בודדות של צלחת 96-גם V-תחתון. באמצעות צלחת V-bottom 96 גם מקלה מסירת דוגמאות רבות.
   2. טרום דגירת השעית התא עם 1 מיקרוגרם עכבר Fc בלוק מטוהר אנטי עכבר CD16 / CD32 ב 100 μl של חיץ FACS במשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצלחת היטב 96 V-תחתון עד גלולת התאים ולהסיר את supernatant ידי הפיכת הצלחת ולתת לטמיון הפתרון.
   3. עבור מכתים משטח, מראש, לדלל את נוגדני Murinדואר אנטיגנים בצינור אחד (תערובת אמן): CD45 BV605 (30-F11), CD11b PE (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 לי ^A / אני ^{ה '(MHCII)} (M5 / 114.152), CD80 PE (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל במאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של CD16 בלוק Fc / CD32 נוֹגְדָן.
      הערה: זו קבוצה של נוגדנים שימושית לזיהוי ההערכה של מצב תפקודי של מקרופאגים מכתשיים ותאים דנדריטיים.
   4. הוספת 100 μl של נוגדנים מדוללים (תערובת אב) בארות צלחת V-bottom 96 באר לדגור על 4 צלזיוס למשך 30 דקות.
   5. צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהסיר supernatant כמו 5.2.2. שטפו תאים עם 200 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant כמו 5.2.2. ו resuspend התאים 200 μl של PBS.
   6. צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהוסיף צבע כדאיות מדולל PBS (1: 1,000). דגירה במשך 20 דקות ב 4 ג.
   7. צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהסיר את supernatant כמו 5.2.2. לשטוף עם 200 μl של PBS ו צנטריפוגות הצליח שוב.
   8. תאים Resuspend ב 100 μl של 1% paraformaldehyde ולאחסן ב 4 ° C עד הרכישה על ידי מכשיר FACS. לפני מתלי תא עברת רכישה ועד צינורות פוליפרופילן FACS.

6. ניתוח של נתוני FACS: אסטרטגיות Gating ואת זיהוי של תת-אוכלוסיות ניידות

1. ביצוע ניתוח FACS כפי שדווח בעבר ^10. שער רכש תאים / אירועים על בסיס צופה (FSC) וצד פיזור (SSC); ואז השער לחיות CD45 ⁺ תאים. לצורך זיהוי מקרופאג המכתשית, CD11b שלילי השער ולאחר מכן CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ תאים. (איור 5 א).

תוצאות

ההזרקה של תאים סרטניים 4T1-GFP לתוך כרית שומן החלב מובילה להיווצרות של גידולי עכבר (איור 1 א) כי לשחזר את ההתפשטות גרורתית של סרטן השד אנושי, כמו גרורות נוצרות במהירות בתוך הריאות (איור 2), כבד, עצמות והמוח של עכברים ^11. Transfection יציב ש...

Discussion

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP