Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Riepilogo

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Abstract

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Introduzione

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protocollo

Tutti gli studi su animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e del Comitato L'uso della Texas Tech University Health Sciences Center e seguito le linee guida indicate nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio", pubblicato dal National Institutes of Health. Utilizzare otto a dodici settimane di età topi BALB / c femmine che sono disponibili in commercio. Iniettare 1 x 10 ⁵ 4T1 o 1 x 10 ⁵ 4T1 cellule che esprimono GFP, che può essere acquistato da vari fornitori, nel cuscinetto di grasso mammaria.

1. Cultura di 4T1 e 4T1-cellule GFP & Preparazione del tumore delle cellule di sospensione per preparazioni iniettabili ¹⁴

1. 4T1 e 4T1-GFP Cell Culture
   NOTA: Eseguire tutte le operazioni che utilizzano soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare (LAF) cabinet biosicurezza se non diversamente specificato.
   1. Mantenere le cellule 4T1 e 4T1-GFP in terreno RPMI supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillinaG e 100 ug / ml di streptomicina solfato.
      NOTA: Determinare un numero passaggio contando ogni tripsinizzazione e la placcatura delle cellule. È importante utilizzare cellule con lo stesso numero di passaggio tutti gli esperimenti di topo, come il numero di passaggi colpisce tumorigenicità delle cellule e potenziale metastatico.
   2. Prima di iniezioni di cellule togliere il pallone T75 cm ^2, che contiene le cellule tumorali a 80% di confluenza, da un mezzo incubatore e aspirare. Aggiungere 10 ml di PBS e ruotare la beuta delicatamente per lavare media residua, e quindi aspirare PBS.
   3. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina con EDTA al pallone e inclinarlo di distribuire la soluzione uniformemente sulla superficie e incubare in un incubatore umidificato per 3 min a 37 ° C con 5% di CO _2.
   4. Toccare il pallone per facilitare il distacco delle cellule e aggiungere 8 ml di terreno fresco. Pipetta su e giù più volte per interrompere grumi e ottenere una sospensione singola cella.
   5. celle di centrifugazione per 5 min. a 500 xg a RT.Aspirare il surnatante e lavare le cellule in 10 ml di PBS.
   6. Pipetta su e giù più volte per interrompere grumi e ottenere una sospensione singola cella. Prendete 100 ml di una sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando l'analizzatore di vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore.
   7. Calcolare il numero di cellule necessarie per tutte le iniezioni usando la formula: 10 ⁵ cellule per topo x # dei topi utilizzati in un esperimento (sempre preparare le cellule in più per essere su un lato sicuro).
   8. cellule centrifuga come in 1.1.5. Rimuovere il surnatante con cellule aspirazione e risospendere in quantità di PBS fresco richiesto per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino pronto per l'iniezione.
2. 4T1 o 4T1-GFP cellule procedure di iniezione-topo
   1. Il giorno prima dell'iniezione delle cellule tumorali, anestetizzare topi in una camera di induzione con 3% isoflurano. Una volta che i topi sono addormentato e respirare regolarmente, posto tegli mouse su un tampone chirurgico con il naso all'interno del cono, e collegarlo al vaporizzatore isoflurano. Mantenere l'anestesia con il 2,5% isoflurano. Pizzicare la punta del mouse per assicurare che il mouse è anestetizzato.
   2. Applicare la crema di rimozione dei capelli usando un tampone di cotone al sito di iniezione (a destra pettorale cuscinetto di grasso mammaria) e attendere 2 minuti. Pulire il sito utilizzando un tovagliolo di carta bagnata, posizionare il mouse nella gabbia e monitorare un animale fino a quando non riprende conoscenza sufficiente a mantenere il decubito sternale.
   3. Il giorno di iniezione, anestetizzare i topi come in 1.2.2 e posizionare sul pad chirurgica.
   4. Agitare la provetta contenente le cellule tumorali per ottenere sospensione cellulare uniforme. Aspirare 100 ml di una sospensione di cellule, contenenti 1 x 10 ⁵ cellule tumorali, in una siringa da insulina da 0,5 ml (29 g, 12,7 mm di lunghezza-ago).
   5. Sollevare la pelle utilizzando l'indice pollice e l'indice vicino al 2 ^° e 3 ^° capezzolo, inserire l'ago della siringa nel Mammarcuscinetto adiposo y appena sotto il terzo capezzolo sotto la pelle tra le dita e iniettare cellule lentamente per formare una bolla (iniezione sottocutanea).
   6. Posizionare il mouse nella gabbia dopo l'iniezione e monitorare come in 1.2.2.
3. Monitoraggio crescita tumorale
   1. Misure pinza ¹⁴
      NOTA: iniettato 4T1 o 4T1-GFP cellule formano tumore al seno aggressivo. Di solito i tumori palpabili appaiono ~ al giorno 4-5 dopo l'inoculazione di cellule. cellule 4T1-GFP formare tumori che crescono più lentamente e dare metastasi in seguito. Misurare il tumore da due a tre volte la settimana. Se lo stato clinico degli animali si deteriora, gli animali perdono più del 10% del peso corporeo, i tumori superano il 10% del peso corporeo o diventare ulcerata, eutanasia topi immediatamente.
      1. Anestetizzare un mouse come in 1.2.1., Pesare, posto sul pad chirurgica e bagnare la zona con il 70% di etanolo.
      2. Palpare tumore nel sito di iniezione (4 - 5 giorni dopo l'inoculazione di cellule).
      3. Misurare il diametro (D) e di diametro minore (d1) con una pinza.
      4. Calcolare il volume del tumore usando la formula del volume = (DX d1 X d1) / 2 mm ^3. Monitorare il recupero del mouse dall'anestesia come in 1.2.2.
   2. Imaging (Solo per 4T1 cellule GFP)
      1. Anestetizzare il mouse come in 1.2.1. Posizionare il mouse su un palco mobile all'interno dello strumento di imaging. Mantenere l'anestesia attraverso il cono di naso.
      2. Accendere lo strumento di imaging e la sorgente di luce secondo le istruzioni del produttore.
      3. Sotto la "Acquisizione" scheda andare a "Illuminazione" e passare alla posizione vuota (senza filtro) per la luce bianca. Assicurarsi che il motore di luce è accesa e selezionare 'Trans' nella tabella luce.
      4. Nella scheda "Microscope", selezionare il filtro "Clear" emissione e l'ingrandimento 0.5X. Nella scheda "Camera", assicurarsi che la categorizzazione per la cattura è '1 x 1' e l'anteprima '4 x 4'.
      5. Clicca su anteprima per individuare il tumore in luce bianca, messa a fuoco per ottenere un'immagine chiara, e fare clic su cattura.
      6. Vai alla scheda di illuminazione e di cambiamento "Acquisizione" per filtrare 1 (filtro per GFP come da istruzioni del produttore). Nella scheda "Microscope", cambia filtro per le emissioni a "530/20 GF". acquisizione di immagini in anteprima e in un canale verde. Regolare il tempo di esposizione per ottenere la luminosità appropriata.
      7. Applicare pseudocolore all'immagine e salvare nella cartella appropriata (Figura 1).

2. intranasale somministrazione di liposomi ¹⁰

NOTA: Eseguire tutte le operazioni che utilizzano soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare (LAF) cabinet Bio-sicurezza se non diversamente specificato.

1. Il giorno 6 dopo l'iniezione delle cellule tumorali anestetizzare topi come in 1.2.1.
2. Agitare la sospensione clodronato o il controllo liposomi (PBS) da parte del produttore. Prendere 60 microlitri liposomi suspension utilizzando sterili punta della pipetta.
3. Rilasciare lentamente la soluzione di liposomi (5 ml ogni volta) in prossimità delle narici che permettono il mouse per respirare nella soluzione, ripetere fino a quando viene somministrata l'intera dose di 60 ml.
4. Sia il mouse riprenda conoscenza prima di metterlo di nuovo in gabbia.
5. amministrazione liposomi Ripetere ogni 3 giorni fino al topi vengono sacrificati. Non somministrare liposomi in un giorno di sacrificio.

3. Il sacrificio del mouse e del tessuto Collection

NOTA: L'uso autoclave e strumenti sterili per la dissezione del mouse. Euthanize topi mentre sotto anestesia attraverso il dissanguamento e rimozione degli organi vitali.

1. Il giorno 22 (Per 4T1 cellule) o il giorno 26 (per le cellule 4T1-GFP) dopo l'iniezione delle cellule tumorali anestetizzare il mouse come in 1.2.1. e posizionare sul pad chirurgica con un cono collegato al vaporizzatore, mantenere l'anestesia come in 1.2.1. Pizzicare una delle dita per garantire che il mOuse è incosciente.
2. Pin le dita dei piedi utilizzando aghi alla scheda di dissezione. Spruzzare etanolo sulla pelle mouse.
3. Sollevare la pelle utilizzando una pinza e fare un'incisione con le forbici chirurgiche. esporre Lentamente il peritoneo e continuare a tagliare la pelle attraverso il torace fino al collo.
4. Utilizzando le forbici chirurgiche fare un'incisione nel peritoneo ed esporre con cura gli organi con le punte di cotone evitando danni ai vasi sanguigni.
5. Spostare gli organi di lato ed esporre la vena cava inferiore. Forare la vena e raccogliere il sangue con la siringa da insulina 29 G. Posizionare sangue raccolto nel tubo e lasciare in ghiaccio per ulteriori elaborazioni.
6. Tagliare il diaframma per esporre i Gabbia toracica, i polmoni e il cuore. Lentamente tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati con la taglierina dell'osso e sollevare la parte superiore della gabbia toracica. Afferra cuore con una pinza e tagliare il tessuto connettivo che collega il cuore e polmoni alla cavità toracica.
7. Posizionare i polmoni in piccola quantità di PBS in 60 millimetricapsula di Petri sul ghiaccio fino al momento per l'imaging e il successivo trattamento di sezioni congelate per microscopia immunofluorescenza o istologia di routine [compresi ematossilina e eosina (H & E) colorazione].

4. polmone metastasi valutazione

1. Contare e segnando metastasi di superficie
   1. Porre la capsula di Petri con i polmoni sotto il microscopio di dissezione. Mettere a fuoco per ottenere una visione chiara della superficie del polmone.
   2. Utilizzando un microscopio dissezione osservare la superficie del polmone. Contare metastasi sui lati anteriore e posteriore di entrambi i polmoni.
      NOTA: Il polmone normale è biancastro o rosato e porosa ed ha una spugna come la struttura. Metastasi 4T1 sono solidi e non porosa, a volte sembra essere simile ad una goccia di liquido (Figura 2A).
2. l'imaging polmonare
   1. Porre la capsula di Petri con i polmoni sul palco mobile all'interno dello strumento di imaging.
   2. Accendere lo strumento e laBioLite fonte multispettrale. Aprire il software. Nella scheda, "Acquisizione", andare a "illuminazione", e passare alla posizione vuota (senza filtro) per la luce bianca. Luce del motore -> ON, Tavolo luminoso -> Epi. Sotto il "microscopio" Selezionare la scheda 'Clear' filtro per le emissioni e l'ingrandimento 1.66X. Nella scheda "Camera", assicurarsi che la categorizzazione per la cattura è '1 x 1' e l'anteprima '4 x 4'.
   3. Fare clic su Anteprima e concentrarsi per avere un quadro chiaro di polmoni in luce bianca e fare clic su cattura.
   4. Vai alla scheda "Acquisizione" e variazione della frequenza di 1 (filtro per GFP come da istruzioni del produttore). Nella scheda "Microscope", cambia filtro per le emissioni a "530/20 GF". acquisizione di immagini in anteprima e in un canale verde. Regolare il tempo di esposizione per ottenere la luminosità appropriata.
   5. Applicare pseudocolore all'immagine e salvare nella cartella appropriata.
   6. Vibrazione polmoni per ottenere l'immagine del lato in modo simile. Questo procedure genera immagini di metastasi GFP-positive che può essere ulteriormente quantificati utilizzando il software appropriato (Figura 2B) ^14.
3. immunofluorescenza Microscopia
   1. Fissare polmoni in 4% paraformaldeide, a 4 ° C per 4 ore in scuro.
   2. Lavare il tessuto due volte con 10 ml di PBS per 5 minuti per rimuovere completamente il fissativo. Trasferimento al 18% di saccarosio in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
   3. Rimuovere il tessuto dal saccarosio e tamponare la parte in eccesso.
   4. Prendete un cryomold, coprire lo strato inferiore con il mezzo ottobre Posizionare il tessuto sul supporto ottobre Riempire lo stampo con il mezzo di Office per ricoprire completamente il tessuto e posto su ghiaccio secco.
   5. blocco Conservare a -80 ° C fino sezionamento.
   6. Preparare 5 sezioni micron di spessore con un criostato e posto su slitte cariche.
   7. Conservare i vetrini utilizzati in -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo.
   8. Far asciugare i vetrini per 7 minuti. e lavare con PBS per rimuovere ottobre Wipe la slitta con i tessuti o tovagliolo di carta per rimuovere l'eccesso di acqua, montaggio scivola copertura con terreno contenente DAPI montaggio e visualizzare con filtro GFP sotto il microscopio.
   9. Quantificare metastasi GFP (Figura 3a) con l'uso di software appropriato ^14.
4. Istologia e Patologia Digitale
   1. Fare clic sul pulsante di richiamo manuale nella scheda di partenza e attendere che la diapositiva tenendo cremagliera per espellere dallo scanner.
   2. Prendere la sezione di tessuto H & E macchiato, pulirlo con il tessuto per rimuovere lo sporco, e posizionarlo in modo sicuro nel portavetrini tenuta.
   3. Inserire la descrizione di scorrimento nella finestra spuntato-up.
   4. Selezionare la scheda Area di scansione nella finestra di console di imaging SS e regolare il quadrato verde per definire la regione di interesse (ROI) da sottoporre a scansione.
   5. Trascinare il diamante blu di calibrazione per una parte chiara della diapositiva, dove il tessuto è assente, tuttavia, all'interno del ROI.
   6. Quindi, selezionare la messa a fuoco Points scheda e fare clic sul pulsante di selezione automatica per ottenere diversi punti di messa a fuoco (giallo segni più) sul tessuto nella ROI.
   7. Se necessario, inserire i punti di messa a fuoco manualmente ulteriori facendo doppio clic all'interno del ROI.
   8. Procedere alla scheda calibrare e selezionare il pulsante di calibrazione per iniziare la calibrazione di scorrimento nella parte blu punta di diamante di calibrazione. Dopo la calibrazione viene completata verrà visualizzata l'immagine dal punto di taratura.
   9. Ispezionare questa immagine per assicurarsi che sia chiaro e privo di sporcizia o artefatti.
   10. Procedere alla scheda Scansione e selezionare Start Scan per avviare la scansione del ROI. Sezione istologica scansito viene convertito in una diapositiva digitale (Figura 3B e 4A)
   11. Quantificare onere metastatico come descritto in precedenza (Figura 4B) ^14.

5. Citometria a flusso (FACS) Analisi di alveolare macrofagi nei polmoni

1. Preparazione della singola cella suspensisopra
   1. Dopo l'imaging e il conteggio delle metastasi, lavare i polmoni con PBS sterile e il luogo per la piastra di Petri. Fare 1 - 2 mm pezzi dei polmoni con le forbici e pinze chirurgiche.
   2. Trasferire i pezzi polmonari al tubo da 15 ml con 3 ml del tampone di digestione contenente 1 mg / ml di collagenasi P, 0.04mg / ml DNasi I, e 10 ug / ml di mezzo RPMI tripsina inibitore disciolto (sterile).
   3. Incubare il tubo conico su un agitatore rotante in incubatrice a 37 ° C per 40 min.
   4. Rimuovere il tubo conico dal termostato e pipetta la soluzione su e giù per dissociare il tessuto.
   5. Far passare la soluzione attraverso il filtro 40 micron per evitare grumi e ottenere una sospensione singola cella. Se necessario, a disintegrarsi meglio il tessuto stampa tessuto digerito contro il filtro cella con l'aiuto di uno stantuffo della siringa.
   6. Quando è stato raggiunto una sospensione singola cella, raccogliere le cellule per centrifugazione e la lisi dei globuli rossi con2 ml di tampone ACK per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, lavare un pellet due volte in 8 ml di RPMI.
   7. Risospendere le cellule in 3 ml del mezzo RPMI completo e procedere alla cella il conteggio utilizzando l'analizzatore di vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore.
2. La colorazione di cellule polmonari per marcatori di superficie
   NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione a 4 ° C. Piastra centrifugare a 500 xg e 4 ° C.
   1. Pipettare 1 x 10 ⁶ cellule in 100 microlitri di tampone FACS (1% FBS in PBS) a singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti V-bottom. Utilizzando un piatto ben 96 V-parte inferiore facilita la consegna di campioni multipli.
   2. Pre-incubare la sospensione cellulare con 1 mg mouse Fc Block purificato anti-topo CD16 / CD32 in 100 ml di tampone FACS per 15 min. Centrifugare il 96 pozzetti V-parte inferiore per far sedimentare le cellule e rimuovere il surnatante girando la piastra e lasciando lo scarico soluzione.
   3. Per la colorazione superficiale, in anticipo, diluire gli anticorpi a Murine antigeni in un tubo (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / I ^E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml in tampone FACS contenente 10 ug / ml di Fc blocco CD16 / CD32 anticorpo.
      NOTA: Questo insieme di anticorpi è utile per l'identificazione e la valutazione di un stato funzionale dei macrofagi alveolari e cellule dendritiche.
   4. Aggiungere 100 ml di anticorpi diluiti (master mix) ai pozzetti della piastra da 96 pozzetti V-parte inferiore e incubare a 4 ° C per 30 minuti.
   5. Centrifugare la piastra a pellet cellule e rimuovere il surnatante come in 5.2.2. Lavare le cellule con 200 ml di tampone FACS, centrifugare a 500 g per 5 min. Rimuovere il surnatante come in 5.2.2. e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS.
   6. Centrifugare la piastra a pellet cellule e aggiungere la vitalità colorante diluito in PBS (1: 1.000). Incubare per 20 minuti a 4 ° C.
   7. Centrifugare la piastra a pellet cellule e rimuovere il surnatante come in 5.2.2. Lavare con 200 ml di PBS e centrifugare nuovamente la piastra.
   8. Risospendere le cellule in 100 ml di 1% paraformaldeide e conservare a 4 ° C, fino all'acquisizione da parte dello strumento FACS. Prima di sospensioni cellulari di trasferimento acquisizione ai tubi in polipropilene FACS.

6. Analisi dei dati FACS: Strategie Gating e l'identificazione di sottopopolazioni cellulari

1. Eseguire l'analisi FACS come riportato in precedenza ^10. Porta acquisito cellule / eventi in base forward (FSC) e side-scatter (SSC); e poi porta dal vivo e CD45 ⁺ cellule. Per alveolari di identificazione dei macrofagi, cancello CD11b-negativi e poi CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ cellule. (Figura 5A).

Risultati

L'iniezione di cellule tumorali 4T1-GFP nel tappetino grasso mammario porta alla formazione di tumori murini (Figura 1A) che ricapitolano la diffusione metastatica del carcinoma mammario, come metastasi stanno rapidamente formate nei polmoni (Figura 2), fegato, ossa e il cervello di topi ^11. La trasfezione stabile di 4T1 cellule con GFP facilita il controllo della crescita tumorale (Figura 1B), il monitoraggio cellule tumo...

Discussione

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP