Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Zusammenfassung

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Zusammenfassung

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Einleitung

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von Institutional Animal Care und Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center und folgen den Leitlinien gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren", veröffentlicht von der National Institutes of Health zugelassen. Verwenden von acht bis zwölf Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse, die im Handel erhältlich sind. Injizieren Sie 1 x 10 ⁵ 4T1 oder 1 x 10 ⁵ 4T1 Zellen, die GFP, die von verschiedenen Anbietern gekauft werden können, in das Brustfettpolster.

1. Kultur von 4T1 und 4T1-GFP - Zellen und Herstellung von Tumorzellsuspension für Injektionszwecke ¹⁴

1. 4T1 und 4T1-GFP Zellkultur
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Biosicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben.
   1. Maintain 4T1 und 4T1-GFP-Zellen in RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin ergänztG und 100 ug / ml Streptomycinsulfat.
      HINWEIS: Bestimmen Sie eine Passage-Nummer von jedem Trypsinierung und Galvanisieren von Zellen zu zählen. Es ist wichtig, die Zellen mit der gleichen Durchgangszahl für alle Maus-Experimente zu verwenden, da die Anzahl der Durchgänge Zelle Tumorigenität und metastatische Potential beeinflußt.
   2. Vor der Zellinjektionen entfernen Sie den T75 cm ² Kolben, Tumorzellen bei 80% Konfluenz enthält, aus einem Inkubator und absaugen Medium. 10 ml PBS und drehen Sie den Kolben vorsichtig restliche Medium zu waschen, und dann PBS absaugen.
   3. 2 ml 0,25% Trypsin - EDTA mit dem Kolben und kippen die Lösung gleichmäßig auf der Oberfläche zu verteilen und es wurde 3 min bei 37 ° C mit 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.
   4. Tippen Sie auf den Kolben Ablösung von Zellen zu erleichtern und 8 ml frisches Medium. Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten.
   5. Zentrifugenzellen für 5 min. bei 500 × g bei RT.Aspirieren den Überstand und wasche Zellen in 10 ml PBS.
   6. Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten. Nehmen Sie 100 ul einer Zellsuspension und die Zellen zählen, um die Lebensfähigkeit der Zellen-Analyzer als den Anweisungen des Herstellers.
   7. Berechnung der Anzahl der für alle Injektionen erforderlich Zellen Formel: 10 ⁵ Zellen pro Maus x Anzahl der Mäuse in einem Experiment verwendet (immer zusätzliche Zellen vorbereiten auf einer sicheren Seite zu sein).
   8. Zentrifugen Zellen, wie in 1.1.5. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Zellen in der Menge an frischer PBS erforderlich , um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erhalten. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie bereit zur Injektion.
2. 4T1 oder 4T1-GFP Zellinjektion-Maus - Verfahren
   1. Am Tag vor der Injektion der Tumorzellen, betäuben Mäuse in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran. Sobald Mäuse schlafen und atmen regelmäßig statt ter die Maus auf einem OP-Pad mit der Nase in der Nase Kegel, und verbinden Sie es mit der Isofluran Verdampfer. Pflegen Anästhesie mit 2,5% Isofluran. Pinch die Maus Zehe, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt.
   2. Bewerben Enthaarungscreme mit einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle (rechte Brustbrustfettpolster) und für 2 Minuten warten. Reinigen Sie die Website ein nasses Papiertuch verwenden, legen Sie die Maus wieder in den Käfig und zu überwachen, ein Tier, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt die Brustlage zu halten.
   3. Am Tag der Injektion, betäuben die Mäuse wie in 1.2.2 und auf den OP-Pad.
   4. Vortex die Röhre Tumorzellen mit einheitlichen Zellsuspension zu erhalten. Aspirat 100 & mgr; l einer Zellsuspension, die 1 x 10 ⁵ Tumorzellen in ein 0,5 ml Insulinspritze (29 G, 12,7 mm-Nadellänge).
   5. Heben Sie die Haut mit dem Daumen und Zeigefinger in der Nähe des ^2. und ^3. Nippel, legen Sie die Nadel der Spritze in die Mammary fat pad knapp unterhalb der dritten Brustwarze unter der Haut zwischen den Fingern und injizieren Zellen langsam eine Blase (subkutane Injektion) zu bilden.
   6. Platzieren Sie die Maus wieder in den Käfig nach der Injektion und zu überwachen, wie in 1.2.2.
3. Überwachung Tumorwachstum
   1. Kalipermessungen ¹⁴
      HINWEIS: Eingespritzte 4T1 oder 4T1-GFP-Zellen bilden aggressive Brusttumor. Normalerweise sind die tastbaren Tumoren erscheinen ~ am Tag 4 - 5 nach Zellinokulation. 4T1-GFP-Zellen bilden Tumoren, die langsamer wachsen und Metastasen später geben. Messen Sie den Tumor zwei- bis dreimal pro Woche. Wenn klinischen Zustand der Tiere verschlechtert, Tiere verlieren mehr als 10% des Körpergewichts übersteigen Tumoren 10% des Körpergewichts oder vereitert werden, einschläfern sofort Mäuse.
      1. Anesthetize eine Maus, wie in Abschnitt 1.2.1., Wiegen, Platz auf dem OP-Pad und benetzen Sie den Bereich mit 70% Ethanol.
      2. Palpieren Geschwulst in der Injektionsstelle (4 - 5 Tage nach der Inokulation Zelle).
      3. Messen der größte Durchmesser (D) und kleineren Durchmesser (d1) mit einem Sattel.
      4. Berechnen Tumorvolumen Formel Lautstärke mit = (DX d1 X d1) / 2 mm ^3. Überwachen Sie die Maus aus der Narkose wie in 1.2.2.
   2. Imaging (Nur für 4T1 GFP - Zellen)
      1. Anesthetize die Maus wie in Abschnitt 1.2.1. Platzieren Sie die Maus auf einer beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments. Pflegen Anästhesie durch die Nase Kegel.
      2. Schalten Sie das Abbildungsinstrument und die Lichtquelle als den Anweisungen des Herstellers.
      3. Unter dem Reiter "Erwerb" Gehe zu "Beleuchtung" und wechseln Sie in die leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Stellen Sie sicher, dass der Light-Engine ist ON und wählen Sie "Trans" in dem Lichttisch.
      4. Unter dem Reiter "Mikroskop", wählen Sie "Clear" Emissionsfilter und 0,5X Vergrößerung. In der "Kamera" Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning "1 x 1 'und Vorschau" 4 x 4'.
      5. Klicken Sie auf Vorschau, den Tumor in weißem Licht ausfindig zu machen, konzentrieren klares Bild zu bekommen, und Capture.
      6. Gehen Sie auf "Acquisition" Registerkarte und ändern Beleuchtung zu filtern 1 (Filter für GFP gemäß Herstelleranweisung). Im "Mikroskop" Registerkarte ändern Emissionsfilter auf "530/20 GF". Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten.
      7. Bewerben Pseudo auf das Bild , und speichern Sie in den entsprechenden Ordner (Abbildung 1).

2. Die intranasale Verabreichung von Liposome ¹⁰

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Bio-Sicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben.

1. Am 6. Tag nach der Tumorzellinjektion betäuben Mäuse wie in Abschnitt 1.2.1.
2. Vortex die Clodronat oder Kontrolle (PBS) Liposomensuspension vom Hersteller erhalten. Nehmen Sie 60 ul Liposomen sUSSETZUNG mit einer sterilen Pipettenspitze.
3. Freisetzung langsam Liposom-Lösung (5 ul jedes Mal) in der Nähe der Nase der Maus ermöglicht in der Lösung zu atmen, wiederholen, bis die gesamte Dosis von 60 & mgr; l verabreicht.
4. Lassen Sie die Maus wieder zu Bewusstsein kommen, bevor es Platzierung in den Käfig zurück.
5. Wiederholen Sie Liposom Verabreichung alle 3 Tage, bis die Mäuse getötet. Nicht anwenden Liposomen an einem Tag des Opfers.

3. Maus-Opfer und Gewebeentnahme

HINWEIS: Die Verwendung autoklaviert und sterile Instrumente für Maus-Dissektion. Euthanize Mäuse während der Narkose durch die Ausblutung und die Entfernung der lebenswichtigen Organe.

1. Am Tag 22 (Für 4T1-Zellen) oder Tag 26 (für 4T1-GFP-Zellen) nach der Injektion von Tumorzellen der Maus, wie in Abschnitt 1.2.1 betäuben. und auf den OP-Pad mit einem Nasenkegel auf Verdampfer verbunden ist, halten Anästhesie wie in Abschnitt 1.2.1. Einklemmen einer der Zehen, dass der m, um sicherzustellen,Ouse ist bewusstlos.
2. Stecken Sie die Zehen mit Nadeln zur Dissektion Bord. Spray Ethanol auf die Haut von Mäusen.
3. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und einen Schnitt machen die chirurgische Schere. Langsam das Peritoneum aussetzen und fortsetzen, bis die Haut am Hals durch den Brustkorb zu schneiden.
4. Unter Verwendung der chirurgischen Schere einen Einschnitt in das Peritoneum machen und sorgfältig die Organe mit Baumwollspitzen ausgesetzt werden Schäden an den Blutgefäßen zu vermeiden.
5. Verschieben Sie die Organe auf der einen Seite und setzen die untere Hohlvene. Die Punktion der Vene und sammeln Blut mit dem 29 G Insulinspritze. Legen Sie gesammelte Blut in das Röhrchen und verlassen auf dem Eis zur weiteren Verarbeitung.
6. Schneiden Sie die Membran der Brustkorb, Lunge und Herz zu belichten. schneiden Sie langsam den Brustkorb auf beiden Seiten des Knochenschneider und heben Sie die Spitze der Brustkorb mit. Ergreifen Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie das Bindegewebe, das Herz und die Lunge in die Brusthöhle verbindet.
7. Platzieren Sie die Lungen in kleinen Menge PBS in den 60 mmPetrischale auf Eis, bis sie bereit für die Bildgebung und die Weiterverarbeitung zu Gefrierschnitten für Immunfluoreszenz-Mikroskopie oder Routine-Histologie [einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung].

4. Lungenmetastasen Bewertung

1. Zählen und Scoring Oberflächen Metastasierung
   1. Legen Sie die Petrischale mit den Lungen unter dem Präpariermikroskop. Konzentrieren Sie eine klare Sicht auf die Lungenoberfläche zu erhalten.
   2. ein Präpariermikroskop Mit der Lungenoberfläche beobachten. Graf Metastasen auf den vorderen und hinteren Seiten der beiden Lungen.
      HINWEIS: Die normale Lunge ist weißlich oder rosa und porös und weist eine schwammartige Struktur. 4T1 Metastasen sind solide und nicht porösen, manchmal scheinen zu einem Tropfen Flüssigkeit (2A) ähnlich zu sein.
2. Lungenbildgebung
   1. Legen Sie die Petrischale mit Lungen auf der beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments.
   2. Schalten Sie das Gerät und dieBioLite Multispektraldaten Quelle. Öffnen Sie die Software. Unter der Registerkarte "Erwerb", gehen Sie zu "Beleuchtung", und wechseln Sie in leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Light Engine -> ON, Lichttisch -> Epi. Unter dem Reiter "Mikroskop" Wählen Sie "Löschen" Emissionsfilter und Vergrößerung 1.66X. In der "Kamera" Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning "1 x 1 'und Vorschau" 4 x 4'.
   3. Klicken Sie auf Vorschau und konzentrieren sich ein klares Bild von der Lunge in weißes Licht zu erhalten und Capture.
   4. Gehen Sie (für GFP-Filter gemäß Herstelleranweisung) an den Filter 1 auf "Acquisition" Registerkarte und ändern. Im "Mikroskop" Registerkarte ändern Emissionsfilter auf "530/20 GF". Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten.
   5. Bewerben Pseudo auf das Bild, und in entsprechenden Ordner speichern.
   6. Flip die Lungen Bild der anderen Seite in ähnlicher Weise zu erhalten. Diese procEDURE erzeugt Bilder von GFP-positiven Metastasen , die weitere geeignete Software (2B) quantifiziert werden kann unter Verwendung von ^14.
3. Immunfluoreszenz - Mikroskopie
   1. Fixieren die Lungen in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 4 Stunden in Dunkelheit.
   2. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 10 ml PBS für 5 Minuten, um vollständig das Fixiermittel zu entfernen. Übertragen auf 18% Saccharose in PBS und O / N bei 4 ° C inkubiert.
   3. Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharose und abtupfen überschüssige.
   4. Nehmen Sie einen cryomold, decken Sie die untere Schicht mit Oktober Medium. Legen Sie das Gewebe auf Oktober Medium. Füllen Sie die Form mit Oktober Medium vollständig in das Gewebe und auf Trockeneis zu decken.
   5. Speicher-Block bei -80 ° C bis zum Schneiden.
   6. Bereiten Sie 5 um dicke Abschnitte mit einem Kryostaten und auf geladene Objektträger.
   7. Nicht gebrauchte Folien in -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
   8. Luft trocknen die Folien für 7 min. und waschen mit PBS Oktober zu entfernen. Wipe der Schieber mit Handtuch Gewebe oder Papier über Wasser zu entfernen, montieren Deckgläser mit Medium mit GFP-Filter unter dem Mikroskop enthält DAPI Montage und zu visualisieren.
   9. Quantifizierung GFP Metastasen (3A) mit der Verwendung von geeigneter Software ^14.
4. Histologie und die digitale Pathologie
   1. Klicken Sie auf die manuelle Last Taste unter der Registerkarte Start und warten auf den Schlitten Rack halten vom Scanner auszuwerfen.
   2. Nehmen Sie die H & E-gefärbten Gewebeschnitt, reinigen Sie es mit Gewebe Schmutz zu entfernen, und legen Sie sie sicher in der Dia Haltegestell.
   3. Geben Sie die Dia Beschreibung in knallte-up-Fenster.
   4. Wählen Sie den Scanbereich auf die Registerkarte SS Imaging-Konsolenfenster und stellen Sie den grünen Quadrat der Region of Interest (ROI) zu definieren, gescannt werden.
   5. Ziehen Sie den blauen Kalibrierungs Diamant zu einem klaren Teil des Schlittens, in dem Gewebe nicht vorhanden ist, jedoch innerhalb der ROI.
   6. Als nächstes wählen Sie den Fokus Punkte Registerkarte und klicken Sie auf die Auto-Select-Taste mehrere Fokuspunkte (gelbe Pluszeichen) auf das Gewebe in der ROI zu erzielen.
   7. Falls erforderlich, legen Sie zusätzliche Schwerpunkte manuell durch einen Doppelklick innerhalb des ROI.
   8. Fahren Sie mit der Kalibrier-Menü und wählen Sie die Schaltfläche Kalibrieren Dia Kalibrierung an der blauen Kalibrierungsdiamantspitze zu beginnen. Nach der Kalibrierung das Bild von dem Kalibrierungspunkt abgeschlossen ist, wird angezeigt.
   9. Überprüfen Sie das Bild, um sicherzustellen, dass sie klar und frei von Schmutz oder Artefakte.
   10. Fahren Sie mit der Registerkarte Scannen und wählen Sie Start Scan Scannen des ROI zu beginnen. Abgetastet histologischen Schnitt wird in ein digitales umgewandelt Schieber (3B und 4A)
   11. Quantifizierung metastatic Belastung wie zuvor beschrieben (4B) ^14.

5. Durchflusszytometrie (FACS) Analyse der Alveolarmakrophagen in den Lungen

1. Herstellung von Single Cell Schutzsperreauf
   1. Nach der Bebilderung und das Zählen von Metastasen, waschen Sie die Lungen mit sterilem PBS und in die Petrischale legen. Damit 1 - 2 mm Stücke der Lunge mit chirurgische Schere und Pinzette.
   2. Übertragen die Lungenstücke in die 15 ml konischen Röhrchen mit 3 ml des Verdauungspuffer, enthaltend 1 mg / ml Kollagenase P, 0,04 mg / ml DNase I und 10 ug / ml Trypsininhibitor gelöst RPMI-Medium (steril).
   3. Inkubieren des konischen Rohr auf einer rotierenden Schüttelmaschine im Inkubator bei 37 ° C für 40 min.
   4. Entfernen Sie das Rohr konisch aus dem Inkubator und Pipette die Lösung nach oben und unten um das Gewebe zu distanzieren.
   5. Übergeben Sie die Lösung durch die 40 & mgr; m Sieb zu Klumpen zu vermeiden und eine Einzelzellsuspension erhalten. Falls erforderlich, besser das verdaute Gewebe Pressgewebe gegen die Zellsieb mit Hilfe eines Spritzenkolbens zu zerfallen.
   6. Wenn eine Einzelzellsuspension erreicht worden ist, sammelt die Zellen durch Zentrifugation und Lyse mit roten Blutkörperchen2 ml ACK-Puffer für 10 min bei RT. Dann waschen ein Pellet zweimal in 8 ml RPMI.
   7. Die Zellen in 3 ml des kompletten RPMI-Medium und gehen Sie den Anweisungen des Herstellers, die die Lebensfähigkeit der Zellen Analysator zählen zu Zelle.
2. Die Färbung von Lungenzellen für Oberflächenmarker
   ANMERKUNG: Führen alle Inkubationen bei 4 ° C. Zentrifugenplatte bei 500 xg und 4 ° C.
   1. Pipette 1 x 10 ⁶ Zellen in 100 & mgr; l FACS - Puffer (1% FBS in PBS) in die einzelnen Vertiefungen einer V-Boden 96-Well - Platte. ein V-Boden 96 Well-Platte unter Verwendung erleichtert Gabe von mehreren Proben.
   2. Pre-Inkubation der Zellsuspension mit 1 ug Maus-Fc-Block gereinigt anti-Maus-CD16 / CD32 in 100 ul FACS-Puffer für 15 min. Zentrifugieren Sie die V-Boden 96-Well-Platte, die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu entfernen, indem die Platte Spiegeln und lassen Sie die Lösung abtropfen lassen.
   3. Für die Oberflächenfärbung, im Voraus, verdünnen die Antikörper gegen Murine - Antigene in einem Rohr (Master - Mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (SM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / I ^E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml in FACS - Puffer , enthaltend 10 ug / ml Fc Block CD16 / CD32 Antikörper.
      HINWEIS: Dieser Satz von Antikörpern ist nützlich für die Identifizierung und die Bewertung eines funktionellen Status von alveolären Makrophagen und dendritischen Zellen.
   4. 100 l verdünnte Antikörper (Master-Mix) zu den Vertiefungen der V-Boden 96 Well-Platte und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
   5. Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Überstand wie in 5.2.2. Wasche die Zellen mit 200 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifugation bei 500 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS.
   6. Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und fügen Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt in PBS (1: 1000). Inkubieren für 20 Minuten bei 4 ° C.
   7. Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. Waschen mit 200 ul PBS und Zentrifuge wieder die Platte.
   8. Die Zellen in 100 ul 1% Paraformaldehyd und lagern bei 4 ° C bis zum Erwerb durch FACS-Instrument. Vor der Akquisition Transfer Zellsuspensionen auf die Polypropylen-FACS-Röhrchen.

6. Analyse der FACS Daten: Gating-Strategien und die Identifizierung von Zell-Subpopulationen

1. Führen Sie die FACS - Analyse wie zuvor ¹⁰ berichtet. Tor erworben Zellen / Ereignisse basierend auf zukunfts- (FSC) und Seitenstreuung (SSC); und dann Tor Live und CD45 ⁺ Zellen. Für Alveolarmakrophage Identifizierung, Tor CD11b-negativ und dann CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ Zellen. (5A).

Ergebnisse

Die Injektion von 4T1-GFP Tumorzellen in das Brustfettpolster führt zur Bildung von Mäuse - Tumoren (1A), die die Metastasierung von menschlichen Brustkrebs rekapitulieren, wie Metastasen in der Lunge (2), Leber, Knochen schnell gebildet und das Gehirn von Mäusen ^11. Die stabile Transfektion von 4T1 - Zellen mit GFP erleichtert die Überwachung des Tumorwachstums (1B), metastasierende Tumorzellen verfolgt und Quantifizieren...

Diskussion

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP