Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Özet

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Özet

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Giriş

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu" belirtilen yönergelere Kurumsal Hayvan Bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve takip edilmiştir. ticari olarak temin edilebilir, sekiz haftalık oniki dişi BALB / c fareleri kullanın. Enjekte 1 x 10 ⁵ 4T1 veya 1 x meme yağ yastığı içine, çeşitli satıcılardan satın alınabilir GFP ifade eden 10 ⁵ 4T1 hücreleri.

1. 4T1 Kültür ve 4T1-GFP Hücreler ve Enjeksiyonlar ¹⁴ Tümör Hücre Süspansiyon hazırlanması

1. 4T1 ve 4T1-GFP Hücre Kültürü
   NOT: Aksi belirtilmediği sürece laminar hava akımı (LAF) biyo-güvenlik kabini içinde steril çözümleri kullanarak tüm adımları uygulayın.
   1. RPMI ortamında 4T1 ve 4T1-GFP hücreleri% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 100 U / ml penisilin KorumakG ve 100 ug / ml streptomisin sülfat.
      NOT: Hücrelerin her trypsinization ve kaplama sayarak bir geçit sayısını belirler. geçitlerinin sayısı, hücre tümör oluşum nedenlerinin ve metastaz etki gibi, tüm fare deneylerinde, aynı kanal adedi ile hücrelerin kullanılması önemlidir.
   2. Hücre enjeksiyon öncesinde bir inkübatör ve aspirat ortamından,% 80 birleşme tümör hücreleri ihtiva eden, T75 ^cm2 şişeye çıkarın. PBS 10 ml ekleyin ve kalan orta yıkamak için yavaşça şişeyi çevirin ve sonra PBS aspire.
   3. Şişeye EDTA,% 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve% 5 _CO2 ile 37 ° C'de 3 dakika boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yüzeyi üzerine muntazam bir çözeltisi, dağıtma ve inkübasyona yatırın.
   4. hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırır ve taze ortam 8 ml eklemek için şişeyi hafifçe vurun. yukarı Pipet ve aşağı birkaç kez kümeleri bozmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için.
   5. 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri. Oda sıcaklığında 500 xg'de.Süpernatant aspire ve 10 ml PBS hücrelerin yıkayın.
   6. yukarı Pipet ve aşağı birkaç kez kümeleri bozmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için. Bir hücre süspansiyonu 100 ul alır ve imalatçının talimatlarına göre hücre canlılığı analizörü kullanarak hücreleri sayın.
   7. Bir deneyde kullanılan farelerin fare x # başına 10 ⁵ hücreleri (her zaman güvenli tarafta olmak için ekstra hücreleri hazırlamak): formülünü kullanarak tüm enjeksiyonlar için gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın.
   8. 1.1.5 gibi Santrifüj hücreleri. Taze PBS miktarda aspirasyon ve tekrar süspansiyon hücrelerinden süpernatantı 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için gereken. Enjeksiyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
2. 4T1 veya 4T1-GFP Hücre Enjeksiyon-fare Prosedürleri
   1. tümör hücre enjeksiyonu gün önce,% 3 izofluran ile bir indüksiyon odasında fareler uyutmak. Fareler uyurken ve düzenli olarak nefes sonra, yer to burun konisi içinde burun cerrahi pad üzerinde fare ve izofluran buharlaştırıcı bağlayın. % 2.5 izofluran ile anestezi koruyun. fare anestezi sağlamak için fare ayak sıkıştırın.
   2. enjeksiyon yerinde bir pamuklu bir bez (sağ göğüs meme yağ pedi) ile epilasyon kremi uygulayın ve 2 dakika bekleyin. ıslak kağıt havlu kullanarak siteyi temizleyin, geri kafesin içine fare koyun ve sternum yatma korumak için yeterli bilinç kavuşur kadar bir hayvan izlemek.
   3. Enjeksiyon gününde, 1.2.2 gibi fareler uyutmak ve cerrahi yastığı yerleştirin.
   4. homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için tümör hücreleri içeren tüp Vortex. Aspire 0.5 ml insülin şırıngaya 1 x 10 ⁵ tümör hücrelerini ihtiva eden bir hücre süspansiyonu, 100 ul, (29 g, 12.7 mm iğne uzunluğu).
   5. 2 ^nci ve 3 ^üncü meme ucu yakınında başparmak ve parmak dizini kullanarak cilt kaldırın, mammar içine şırınga iğneyiy şişman sadece parmaklar arasında cilt altında üçüncü meme ucunun altında ped ve enjekte hücreleri yavaş yavaş bir kabarcık (deri altı enjeksiyon) oluşturmak için.
   6. geri enjeksiyondan sonra kafesin içine fare koyun ve 1.2.2 deki gibi izler.
3. İzleme Tümör Büyüme
   1. Kaliper Ölçümleri ¹⁴
      NOT: 4T1 Enjekte veya 4T1-GFP hücreleri agresif meme tümör oluştururlar. Hücre aşılamadan sonra 5 - Genellikle aşikar tümörler 4. günde ~ görünür. 4T1-GFP hücrelerinin yavaş büyür ve daha sonra metastaz vermek tümörler oluşturur. tümöre iki ya da üç kez bir hafta ölçün. Hayvanların klinik durumu bozulursa, hayvanlar tümörler vücut ağırlığının% 10'unu ya da hemen fareler euthanize, ülsere hale,% 10'dan fazla vücut kilo.
      1. . 1.2.1'deki gibi bir fare anestezisi cerrahi yastığı, yer tartmak ve% 70 etanol ile bölgeyi ıslak.
      2. (- 5 gün Hücre aşılamadan sonra 4) enjeksiyon sitesinde tümör palpe ediniz.
      3. bir çap pergeli ile en büyük çapa (D) ve daha küçük çaplı (D1) ölçün.
      4. Formül Hacmi = (DX d1 X d1) / 2 mm ³ ile tümör hacmini hesaplayın. 1.2.2 gibi anestezi fare kurtarma izleyin.
   2. Görüntüleme (Sadece 4T1 GFP Hücreleri)
      1. 1.2.1 gibi fare anestezisi. görüntü aygıtı içinde hareketli bir sahnede fare yerleştirin. burun konisi ile anestezi korumak.
      2. görüntü aygıtı ve üreticinin talimatlarına göre ışık kaynağı açın.
      3. sekme "Acquisition" altında "Aydınlatma" bölümüne gidin ve beyaz ışık için boş pozisyon (herhangi bir filtre) geçmek. ışık motoru AÇIK olduğundan emin olun ve ışıklı masada 'Trans' seçeneğini seçin.
      4. sekme "Mikroskop" altında, "Temizle" emisyon filtresi ve 0.5x büyütme seçin. "Kamera" sekmesinde, yakalanması için binning '1 x 1' ve önizleme '4 x 4' olduğundan emin olun.
      5. Beyaz ışık tümörü bulmak için önizleme tıklayın net bir görüntü elde etmek odaklanmak ve yakalama tıklayın.
      6. 1 (üreticinin talimatlarına göre GFP için filtre) filtre "Toplama" sekmesine ve değişim aydınlatma gidin. "Mikroskop" sekmesinde, "530/20 GF" emisyon filtresini değiştirin. yeşil kanal Önizleme ve yakalama görüntüsü. uygun parlaklık elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
      7. Görüntüye Pseudocolor uygulayın ve uygun klasöre (Şekil 1) kaydedin.

Lipozomlar ¹⁰ 2. Burun içinden tatbikat

NOT: Aksi belirtilmediği sürece laminar hava akımı (LAF) Biyo-güvenlik kabini içinde steril çözümleri kullanarak tüm adımları uygulayın.

1. Tümör hücresi enjeksiyonundan sonra 6. günde 1.2.1'deki gibi fareler uyutmak.
2. üreticinin elde edilen klodronat ya da kontrol (PBS) lipozom süspansiyonu Vortex. lipozom s ul 60 atınAskı steril pipet kullanarak.
3. Yavaşça, fare çözeltide nefes almasını sağlar burun yakın (5 ul her zaman) lipozom çözümü bırakın 60 ul tüm dozu kadar tekrarlayın.
4. Fare kafesine geri koymadan önce bilincini kazanmak olsun.
5. Tekrarlama lipozom yönetim fareler kadar her 3 günde kurban edilmiştir. fedakarlık bir günde lipozomlar yönetmek etmeyin.

3. Fare Kurban ve Doku Koleksiyonu

NOT: otoklava ve fare diseksiyon için steril aletler. ise hayati organların kan kaybından ve çıkarılması ile anestezi altında fareler Euthanize.

1. 22. günde veya gün (4T1 hücreleri için) 26 tümör hücresi enjeksiyonundan sonra (4T1-GFP hücreleri için) 1.2.1 gibi fare uyutmak. ve, buharlaştırıcı bağlı bir burun konisi ile cerrahi pad üzerinde yer 1.2.1'deki gibi anestezi korumak. m emin olmak için ayak birini Pinchouse baygın.
2. diseksiyon kurulu iğneler kullanılarak ayak sabitleyin. Fare cilt üzerinde etanol püskürtün.
3. forseps kullanarak cilt kaldırın ve cerrahi makas ile bir kesi yapmak. Yavaşça periton ortaya çıkarmak ve boyun kadar toraks sayesinde cildi kesme devam edin.
4. cerrahi makas kullanarak periton bir kesi yapmak ve kan damarlarına zarar gelmesin pamuk ipuçları dikkatlice organları maruz kalmaktadır.
5. bir tarafa organları taşımak ve inferior vena kava maruz kalmaktadır. ven delinme ve 29 G insülin şırınga ile kan toplamak. tüp içine toplandı ve kanın ve daha sonraki işlemler için buz üzerinde bırakın.
6. göğüs kafesi, akciğerler ve kalp maruz diyaframı kesin. Yavaş yavaş kemik kesici kullanarak her iki tarafta göğüs kafesi kesilmiş ve göğüs kafesi üst kaldırın. forseps ile kalp kapmak ve göğüs boşluğuna kalp ve akciğerler bağlayan bağ dokusu kesti.
7. 60 mm PBS az miktarda akciğerleri yerleştirinimmünofloresan mikroskopi veya [hematoksilin ve eosin (H & E) boyama dahil], rutin histoloji incelemeleri için gereken dondurulmuş bölümleri görüntüleme ve daha fazla işlem için hazır olana kadar buz üzerinde Petri kabı.

4. Akciğer Metastaz Değerlendirilmesi

1. Yüzey Metastazlari Sayma ve Puanlama
   1. diseksiyon mikroskobu altında akciğerler ile Petri kabı yerleştirin. Akciğer yüzeyinin net bir görünüm elde etmek için odaklanın.
   2. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak akciğer yüzeyini gözlemlemek. her iki akciğerde anterior ve posterior tarafta metastaz güvenin.
      NOT: Normal akciğer beyazımsı veya pembemsi ve gözenekli ve yapısı gibi bir sünger vardır. 4T1 metastazı bazen sıvı (Şekil 2A) bir damla benzer gibi görünen, katı ve gözeneksiz vardır.
2. akciğer görüntüleme
   1. görüntü aygıtı içindeki hareketli sahnede akciğerlere ile Petri kabı yerleştirin.
   2. Enstrüman ve açınbantlı kaynak BioLite. yazılımını açın. sekmesinin altında, "Toplama", "Aydınlatma" gidin ve beyaz ışık için boş pozisyon (herhangi bir filtre) geçmek. Işık Motor -> AÇIK, ışık tablo -> Epi. sekme "Mikroskop" altında bulunan 'Clear' emisyon filtresi ve 1.66X büyütme seçin. "Kamera" sekmesinde, yakalanması için binning '1 x 1' ve önizleme '4 x 4' olduğundan emin olun.
   3. önizleme tıklayın ve beyaz ışık akciğerlerin net bir resim elde tıklayınız yakalamak için odak.
   4. (Üreticinin talimatlarına göre GFP için filtre) filtre 1 "Toplama" sekmesine ve değişim gidin. "Mikroskop" sekmesinde, "530/20 GF" emisyon filtresini değiştirin. yeşil kanal Önizleme ve yakalama görüntüsü. uygun parlaklık elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
   5. görüntüye Pseudocolor uygulayın ve uygun klasöre kaydedin.
   6. benzer şekilde diğer tarafın görüntü almak için akciğerlere çevirin. bu procedure ayrıca uygun bir yazılım (Şekil 2B) ¹⁴ kullanılarak belirlenebilir GFP pozitif metastaz görüntüler üretir.
3. immünoflüoresan mikroskopi
   1. karanlıkta 4 saat boyunca 4 ° C 'de,% 4 paraformaldehid içinde akciğerlere düzeltildi.
   2. Tamamen fiksatif kaldırmak için 5 dakika boyunca 10 ml PBS ile iki kez doku yıkayın. PBS içinde% 18 sakroz transfer edildi ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
   3. sukroz doku kaldırmak ve herhangi bir aşırı hafifçe sürün.
   4. Bir cryomold al, Ekim orta alt katmanı kapsar. Ekim ortamında doku yerleştirin. tamamen kuru buz üzerinde doku ve yeri kapsayacak şekilde Ekim orta ile kalıp doldurun.
   5. Kesit kadar -80 ° C'de saklayın bloğu.
   6. yüklü slaytlar üzerinde bir kriyostat ve yer ile 5 mikron kalınlığında kesitler hazırlamak.
   7. Daha fazla kullanıma kadar -80 ° C kullanılmayan slaytlar saklayın.
   8. Hava 7 dakika boyunca slaytlar kurulayın. ve OCT kaldırmak için PBS ile yıkayın. Wipe doku ya da kağıt havluyla slayt, su fazlalığı ortadan kaldırmak DAPI içeren orta montaj kapak fişleri montaj ve mikroskop altında GFP filtre ile görselleştirmek için.
   9. Uygun yazılım ¹⁴ kullanımı ile GFP metastazları (Şekil 3A) ölçmek.
4. Histoloji ve Dijital Patoloji
   1. Başlangıç ​​sekmesi altında manuel yük düğmesini tıklayın ve tarayıcıdan çıkarmak için raf tutan slayt için bekleyin.
   2. H & E lekeli doku bölümünü almak kirleri çıkarmak için doku ile temizleyiniz ve slayt tutan rafa güvenli bir şekilde yerleştirin.
   3. attı-up pencerede slayt açıklama girin.
   4. SS görüntüleme konsol penceresinde Tarama Alanı sekmesini seçin ve faiz (ROI) bölgesini taranacak tanımlamak için yeşil kare ayarlayın.
   5. Doku ROI içinde, ancak, yoktur slayt, net bir kısmına mavi kalibrasyon elmas sürükleyin.
   6. Sonraki Focus P seçinoints sekme ve ROI doku üzerinde birçok odak noktaları elde etmek için otomatik seçim düğmesine (sarı artı işaretleri) tıklayın.
   7. Gerekirse, ROI içinde çift tıklayarak elle ek odak noktalarını yerleştirmek.
   8. kalibre sekmesine geçin ve mavi kalibrasyon elmas noktasında slayt kalibrasyonunu başlatmak için kalibre düğmesini seçin. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra kalibrasyon noktasından görüntü gösterilecektir.
   9. açık ve kir veya eserler serbest olmasını sağlamak için bu görüntüyü kontrol edin.
   10. Tarama sekmesine geçin ve ROI taramaya başlamak için Start Scan seçeneğini seçin. Taranan histolojik bölümü bir dijital slayt dönüştürülür (Şekil 3B ve 4A)
   11. Daha önce (Şekil 4B) ¹⁴ tarif edildiği gibi metastatik yükü ölçmek.

Akciğerler Alveolar Makrofagların 5. Akım Sitometri (FACS) analizi

1. Tek Hücre suspensi hazırlanmasıüzerinde
   1. görüntüleme ve metastaz sayımının ardından steril PBS ile akciğerlere yıkayın ve Petri kabı yerleştirin. cerrahi makas ve forseps kullanarak akciğerlerde 2 mm parçalarını - 1 yapın.
   2. 3, 1 mg / ml kollajenaz P, 0.04mg / ml DNase I içeren sindirim tamponu ml ve 10 ug / ml tripsin çözündürüldü inhibitörü RPMI ortamı (steril), 15 ml konik tüp, akciğer parçaları aktarın.
   3. 40 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde dönen bir çalkalayıcı üzerinde konik tüp inkübe edin.
   4. doku ayırmak için aşağı inkübatör tüp konik çıkarın ve çözüm yukarı pipet ve.
   5. kümeleri önlemek ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron süzgeç vasıtasıyla çözüm geçirin. Gerekirse, bir şırınga pistonu yardımıyla hücre süzgecinden karşı daha iyi sindirilir doku basın doku parçalamaya.
   6. tek bir hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, santrifüj hücreleri toplamak ve kırmızı kan hücrelerinin lizeOda sıcaklığında 10 dakika boyunca ACK tamponunda 2 mi. Daha sonra, RPMI 8 ml bir pelet iki kez yıkayın.
   7. tam RPMI ortamında 3 ml ve yeniden süspanse hücreleri, üreticinin talimatlarına göre hücre canlılığı analizörü kullanarak sayma hücre geçin.
2. Yüzey markerleri Akciğer Hücreleri boyanması
   Not: 4 ° C'de Bütün inkübasyonlar, gerçekleştirin. 500 xg ve 4 ° C'de santrifüj plaka.
   1. Pipet V-tabanlı 96-çukurlu plaka, tek tek oyuklara FACS tamponu (PBS içinde% 1 FBS), 100 ul 1 x 10 ⁶ hücre. Bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka kullanılarak çok sayıda örneğin aktarma işlemleri kolaylaştırır.
   2. 1 ug fare Fc Block hücre süspansiyonu önceden inkübe 15 dakika boyunca FACS tampon 100 ul CD32 / anti-fare CD16 arıtıldı. pelet hücreleri ve plaka saygısız ve çözüm tahliye izin vererek süpernatant kaldırmak için V-tabanlı 96 plaka santrifüj.
   3. yüzeyi boyama, önceden, murin antikorları sulandırmakBir tüp (master miks) e antijenleri: BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 ^a / Fc Block CD16 10 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu 2.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar I ^S (MHC II) (M5 / 114,152), PE, CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 antikor.
      Not: antikor kümesi tanımlanması ve alveoler makrofajlar ve dendritik hücrelerin fonksiyonel durumunun değerlendirilmesi için faydalıdır.
   4. V-tabanlı 96 çukurlu bir levhanın çukurlarına seyreltilmiş antikor (ana karışım), 100 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. pelet hücreleri ve 5.2.2 gibi süpernatant kaldırmak için plakayı santrifüj. 5 dakika için 500 g'da FACS tampon 200 ul, santrifüj ile hücreler yıkanır. 5.2.2 gibi süpernatantı. ve 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
   6. PBS (: 1000 1) seyreltilmiş canlılık boya pelet hücreleri ve eklemek plaka santrifüj. 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
   7. pelet hücreleri ve 5.2.2 gibi süpernatant kaldırmak için plakayı santrifüj. PBS 200 ul yıkayın ve tekrar plaka santrifüj.
   8. FACS cihaz tarafından satın alınana kadar, 4 ° C'de,% 1 paraformaldehit ve mağaza 100 ul içinde süspanse hücreleri. polipropilen FACS tüplere edinme transferi hücre süspansiyonları önce.

6. FACS Verilerin Analizi: Yolluk Stratejileri ve hücre alt tanımlanması

1. Daha önce ¹⁰ bildirildiği gibi FACS analizi gerçekleştirmek. Kapı hücreleri ileriye (FSC) dayalı / olayları ve yan dağılım (SSC) edinilen; ve daha sonra, canlı kapısı ve CD45 ⁺ hücreleri. Alveoler makrofaj tanımlanması için, kapı negatif CD11b-ve sonra CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ hücreleri. (Şekil 5A).

Sonuçlar

Metastazı hızla akciğer (Şekil 2), karaciğer, kemik içinde oluşturulmuş olarak memenin yağlı pedine 4T1-GFP tümör hücrelerinin enjeksiyonu, insan göğüs kanseri, metastatik yayılması özetlemek fare tümörleri (Şekil 1A) oluşumuna yol açar ve farelerin ¹¹ beyin. GFP ile 4T1 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu, tümör büyümesinin izlenmesini kolaylaştırır (Şekil 1B), metastaz tümör hücreleri, iz...

Tartışmalar

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP