Изучение роли альвеолярных макрофагах при раке молочной железы Метастазы

Резюме

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Аннотация

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Введение

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Техасского университета Центра Наук Здоровья и следовали принципам, изложенным в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных", опубликованной Национальным институтом здравоохранения. Использование восьми до двенадцати недельных самок мышей BALB / C мышей, которые являются коммерчески доступными. Вводят 1 х 10 ⁵ 4T1 или 1 х 10 ⁵ 4T1 клетки , экспрессирующие GFP, который можно приобрести у различных поставщиков, в жировой ткани молочных желез.

1. Культура 4T1 и 4T1-GFP клетки и подготовка опухоли клеточной суспензии для инъекций ¹⁴

1. 4T1 и 4T1-GFP Культура клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги с использованием стерильных растворов в ламинарном потоке воздуха (LAF) биологической безопасности кабинета, если не указано иное.
   1. Поддерживать 4Т1 и 4Т1-GFP клетки в RPMI среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка и 100 ед / мл пенициллинаG и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата.
      Примечание: Определить количество проходов путем подсчета каждый трипсинизации и покрытие клеток. Важно, чтобы использовать клетки с тем же самым числом пассажей всех экспериментах мышей, поскольку число проходов влияет клеток онкогенность и метастатический потенциал.
   2. Перед инъекциями клеток удалить T75 см ² колбы, содержащей опухолевые клетки на 80% сплошности, из инкубатора и аспирата среды. Добавьте 10 мл PBS и вращать колбу осторожно, чтобы промыть оставшийся носитель, а затем аспирация PBS.
   3. Добавляют 2 мл 0,25% трипсина с ЭДТА в колбу и наклонить его , чтобы распределить раствор равномерно на поверхности и инкубировать в увлажненном инкубаторе в течение 3 мин при 37 ° С с 5% CO _2.
   4. Нажмите колбу, чтобы облегчить отделение клеток и добавить 8 мл свежей среды. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки и получить клеточную суспензию.
   5. Центрифуга клетки в течение 5 мин. при 500g при комнатной температуре.Аспирируйте супернатант и промыть клетки в 10 мл PBS.
   6. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки и получить клеточную суспензию. Возьмите 100 мкл суспензии клеток и подсчета клеток с использованием анализатора жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
   7. Подсчитайте количество клеток , необходимых для всех инъекций по формуле: 10 ⁵ клеток на мышь х # мышей , используемых в эксперименте (всегда готовятся дополнительные ячейки , чтобы быть на безопасной стороне).
   8. Центрифуга клетки, как в 1.1.5. Удалить супернатант через аспирацией и ресуспендируют клеток в количестве свежего PBS , необходимое для получения конечной концентрации клеток 1 × 10 ⁶ клеток / мл. Держите клеточной суспензии на льду до готовности к инъекции.
2. Процедуры инъекции мыши 4Т1 клеток или 4T1-GFP
   1. За день до инъекции опухолевых клеток, обезболить мышей в индукционной камере с 3% изофлуран. После того, как мыши спят и регулярно дышать, место тон мыши на хирургическом площадку с носом внутри носового конуса, и подключить его к изофлурановым испарителем. Поддержание анестезии с 2,5% изофлуран. Сожмите палец мыши, чтобы гарантировать, что мышь находится под наркозом.
   2. Нанесите крем для удаления волос с помощью ватного тампона на месте инъекции (правая грудная молочной жировой ткани) и подождать в течение 2 мин. Очистите участок, используя влажное бумажное полотенце, положите мышь обратно в клетку и контролировать животное, пока он не восстановит достаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее.
   3. В день инъекции, анестезию мышей, как в пункте 1.2.2 и поместить на хирургическом площадку.
   4. Vortex трубки, содержащей опухолевые клетки, чтобы получить однородную суспензию клеток. Отберите по 100 мкл клеточной суспензии, содержащих от 1 х 10 ⁵ опухолевых клеток в инсулиновый шприц объемом 0,5 мл (29 г, 12,7 мм длина иглы).
   5. Подтяжка кожи с помощью индекса большим и указательным пальцем возле 2 - ^й и 3 - ^й сосок, вставьте иглу шприца в Mammarу жировой ткани чуть ниже третьего соска под кожу между пальцами и инъекционные клетки медленно с образованием пузырьков (подкожной инъекции).
   6. Поместите мышь обратно в клетку после инъекции и контролировать, как и в пункте 1.2.2.
3. Рост опухоли Мониторинг
   1. Суппорт Измерения ¹⁴
      Примечание: Введенный 4T1 или 4T1-GFP клетки образуют агрессивную опухоль молочной железы. Обычно ощутимой опухоли появляются ~ в 4-й день - 5 после инокуляции клеток. 4T1-GFP клетки образуют опухоли, которые растут медленнее и дают метастазы позже. Мера опухоль в два-три раза в неделю. Если клиническое состояние животных ухудшается, животные теряют более 10% массы тела, опухоли превышает 10% от массы тела или стать изъязвление, усыпить мышей немедленно.
      1. Обезболить мышь, как и в пункте 1.2.1., Вес, место на хирургическом площадку и намочить область с 70% этанола.
      2. Пропальпируйте опухоль в месте инъекции (4 - 5 дней после того, как инокуляции клеток).
      3. Измерьте наибольший диаметр (D) и меньший диаметр (D1) с суппортом.
      4. Рассчитать объем опухоли , используя формулу Volume = (DX X d1 d1) / 2 мм ^3. Монитор восстановления мыши от анестезии, как и в пункте 1.2.2.
   2. Обработки изображений (только для 4Т1 GFP клетки)
      1. Обезболить мышь, как и в разделе 1.2.1. Поместите мышь на подвижной стадии внутри прибора визуализации. Поддержание анестезии через носовой конус.
      2. Включите прибор формирования изображения и источника света в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. На вкладке "Приобретение" перейти к "Lighting" и переключиться на пустой позиции (без фильтра) для белого света. Убедитесь, что индикатор работы двигателя и выберите 'Trans' в световом столе.
      4. На вкладке "Микроскоп", выберите "Очистить" эмиссионный фильтр и 0.5x увеличение. На вкладке "Camera", убедитесь, что биннинг для захвата '1 х 1' и предварительный просмотр "4 х 4 '.
      5. Нажмите на превью, чтобы найти опухоль в белом свете, фокус, чтобы получить четкое изображение, и нажмите кнопку захвата.
      6. Перейти к разделу "Приобретение" на вкладке и изменения освещения для фильтрации 1 (фильтр для GFP в соответствии с инструкцией завода-изготовителя). На вкладке "Микроскоп", изменить эмиссионный фильтр на "530/20 GF". Предварительный просмотр и захват изображения в зеленом канале. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы получить соответствующую яркость.
      7. Применить псевдоцвете к изображению и сохранить в соответствующей папке (рисунок 1).

2. интраназальное введение липосом ¹⁰

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги с использованием стерильных растворов в ламинарном потоке воздуха (LAF) Биобезопасность шкафа, если не указано иное.

1. На 6-й день после инъекции опухолевых клеток обезболить мышей, как в 1.2.1.
2. Vortex клодроната или контроля (PBS), полученную суспензию липосом от производителя. Возьмите 60 мкл липосомная suspension с использованием стерильной пипетки.
3. Медленно отпустите липосом раствор (5 мкл каждый раз) вблизи ноздри, позволяя мышь дышать в растворе, повторяют до тех пор, вся доза 60 мкл не вводят.
4. Пусть мышь очнуться перед установкой его обратно в клетку.
5. Повторное введение липосомная каждые 3 дня до мышей умерщвляли. Не управлять липосом в день жертвоприношения.

3. Жертвоприношение мышь и тканей Коллекция

Примечание: Используйте автоклавированы и стерильные инструменты для рассечения мыши. Эвтаназии мышей под наркозом через обескровливание и удаление жизненно важных органов.

1. В день 22 (Для 4Т1 клеток) или день 26 (для 4Т1-GFP клеток) после инъекции опухолевых клеток анестезию мыши, как в 1.2.1. и место на хирургическом площадку с конусообразной, соединенного с испарителем, поддержания анестезии, как и в разделе 1.2.1. Зажмите один из пальцев ноги, чтобы гарантировать, что в мУз находится в бессознательном состоянии.
2. Закрепление пальцы с помощью иглы к рассечение борту. Спрей этанол на кожу мыши.
3. Подтяжка кожи с помощью пинцета и сделать надрез с хирургическими ножницами. Медленно подвергать брюшины и продолжать резки кожи через грудную клетку до шеи.
4. Используя хирургические ножницы сделать разрез в брюшине и тщательно подвергать органы с хлопковыми наконечниками исключается опасность повреждения кровеносных сосудов.
5. Перемещение органов в одну сторону и выставить нижнюю полую вену. Прокол вены и собирают кровь с 29 G инсулина шприц. Поместите собранную кровь в пробирку и оставляют на льду для дальнейшей обработки.
6. Вырезать диафрагму, чтобы выставить грудную клетку, легкие и сердце. Медленно разрезать грудную клетку с обеих сторон с помощью резака кости и поднимите верхнюю часть грудной клетки. Возьмите сердце с пинцетом и вырезать соединительной ткани, соединяющей сердце и легкие в грудной полости.
7. Поместите в легкие в небольшом количестве PBS в 60 ммПетри на льду до готовности для обработки изображений и дальнейшей обработки замороженных срезов для иммунофлуоресцентного микроскопии или рутинной гистологии [в том числе гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание].

4. Метастазы легких Оценка

1. Подсчет и Забив Surface метастазами
   1. Поместите чашку Петри с легкими под микроскопом рассечение. Фокус, чтобы получить четкое представление о поверхности легких.
   2. С помощью микроскопа рассечение наблюдения за поверхностью легких. Граф метастаз на передней и задней сторонах обоих легких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное легкое беловатые или розоватые и пористым и имеет губку, как структура. 4T1 Метастазы являются твердыми и непористой, иногда , как представляется, похожи на капли жидкости (фиг.2А).
2. томография легких
   1. Поместите чашку Петри с легких на подвижной стадии внутри прибора визуализации.
   2. Включите прибор и набиотит мультиспектральных источник. Откройте программное обеспечение. На вкладке "Приобретение", перейдите в раздел "Освещение", и переключиться на пустой позиции (без фильтра) для белого света. Light Engine -> ON, свет стола -> Epi. На вкладке "Микроскоп" Выберите "Очистить" эмиссионный фильтр и 1.66X увеличение. На вкладке "Camera", убедитесь, что биннинг для захвата '1 х 1' и предварительный просмотр "4 х 4 '.
   3. Нажмите на превью и фокус, чтобы получить четкую картину легких в белом свете и нажмите кнопку захвата.
   4. Перейдите на вкладку "Приобретение" и изменение фильтра 1 (фильтр для GFP в соответствии с инструкцией завода-изготовителя). На вкладке "Микроскоп", изменить эмиссионный фильтр на "530/20 GF". Предварительный просмотр и захват изображения в зеленом канале. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы получить соответствующую яркость.
   5. Применить псевдоцвете к изображению и сохранить в соответствующей папке.
   6. Флип легкие, чтобы получить изображение с другой стороны таким же образом. Это Procedure создает образы GFP-положительных метастазов , которые могут быть дополнительно определены количественно с помощью соответствующего программного обеспечения (Рисунок 2B) ^14.
3. иммунофлуоресцентного Микроскопия
   1. Закрепить легкие в 4% параформальдегид, при 4 ° С в течение 4 часов в темноте.
   2. Промыть ткань в два раза с 10 мл PBS в течение 5 мин, чтобы полностью удалить закрепитель. Переход к 18% сахарозы в PBS и инкубировать O / N при температуре 4 ° С.
   3. Удалите ткань из сахарозы и промокните излишки.
   4. Возьмите cryomold, покрывают нижний слой ОКТ среды. Поместите ткань на ОКТ среде. Заполните форму с ОКТ среды, чтобы полностью покрыть ткань и место на сухом льду.
   5. блок Хранить при температуре -80 ° C до секционирования.
   6. Подготовьте 5 мкм толщиной секций с криостата и место на заряженных горками.
   7. Храните неиспользуемые слайды -80 ° С до дальнейшего использования.
   8. Воздух сухой слайдов в течение 7 мин. и промывают PBS для удаления развертывания Office. Wipе слайд с тканью или бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток воды, крепление крышки слипы с монтажной средой, содержащей DAPI и визуализации с фильтром GFP под микроскопом.
   9. Количественно GFP метастаз (рис 3А) с использованием соответствующего программного обеспечения ^14.
4. Гистологии и Digital Патология
   1. Нажмите кнопку ручной загрузки на вкладке запуска и ждать слайд холдинга стойку, чтобы извлечь из сканера.
   2. Возьмите раздел H & E окрашивали ткани, очистить его с тканью, чтобы удалить грязь, и поместить его надежно в слайд держа стойку.
   3. Введите описание слайд в появившемся окне.
   4. Выберите вкладку Область сканирования в окне консоли изображения SS и отрегулируйте зеленый квадрат, чтобы определить область интереса (ROI) для сканирования.
   5. Перетащите синий калибровочный алмаз на прозрачную часть слайда, где ткань отсутствует, однако, в пределах ROI.
   6. Далее, выберите Фокус Points вкладку и нажмите на кнопку Auto Select, чтобы получить несколько точек фокусировки (желтый плюс знаки) на ткани в ROI.
   7. При необходимости, установите дополнительные точки фокусировки вручную с помощью двойного щелчка внутри ROI.
   8. Перейдите на вкладку калибровать и нажмите кнопку калибровки, чтобы начать калибровку слайд в синей точке калибровки алмаза. После завершения калибровки будет отображаться изображение с точки калибровки.
   9. Проверьте это изображение, чтобы убедиться, что это чистой и свободной от грязи или артефактов.
   10. Перейдите на вкладку Scan и выберите Начать сканирование, чтобы начать сканирование ROI. Отсканированное гистологический срез преобразуется в цифровой слайд (рис 3B и 4A)
   11. Количественно метастатического нагрузку , как описано ранее (рисунок 4б) ^14.

5. Проточная цитометрия (FACS) Анализ альвеолярных макрофагах в Легких

1. Получение одноклеточ- Suspensiна
   1. После визуализации и подсчета метастазов, промойте легкие стерильной PBS и поместить в чашку Петри. Сделать 1 - 2 мм кусочки легких с помощью хирургических ножниц и щипцов.
   2. Передача части легких к 15 мл коническую пробирку с 3 мл буферного раствора, содержащего сбраживания 1 мг / мл коллагеназы P, 0.04mg / мл ДНКазы I, и 10 мкг мл трипсин ингибитора растворенной среды / RPMI (стерильный).
   3. Выдержите в конической трубе на вращающемся шейкере в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 40 мин.
   4. Снимите коническую трубку из инкубатора и пипеткой решение вверх и вниз, чтобы отделить ткани.
   5. Пропускают раствор через сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы избежать комков и получить суспензию единичных клеток. При необходимости, чтобы разложить лучше переваренной ткани пресс ткани против ситом клеток с помощью поршня шприца.
   6. Когда одноклеточной суспензии было достигнуто, собирают клетки центрифугированием и лизировали эритроциты с2 мл буфера ACK в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем моют гранулу два раза в 8 мл RPMI.
   7. Ресуспендируют клетки в 3 мл полной среды RPMI и перейти к ячейке подсчета с использованием анализатора жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Окрашивание клетки легких для поверхностных маркеров
   Примечание: Выполнить все инкубацию при 4 ° С. Центрифуга пластины при 500g и 4 ° C.
   1. Пипетка 1 х 10 ⁶ клеток в 100 мкл FACS буфера (1% FBS в PBS) в отдельные лунки V-дно 96-луночного планшета. Использование V-дно 96-луночного планшета облегчает сдачу нескольких образцов.
   2. Инкубировать клеточной суспензии с 1 мкг Fc мыши Block очищенные анти-CD16 мыши / CD32 в 100 мкл буфера FACS в течение 15 мин. Центрифуга V-дно 96-луночного планшета для осаждения клеток и удалить супернатант, переворачивая тарелку и дать утечку раствора.
   3. Для поверхностного окрашивания, заранее, разбавить антитела к Муринае антигены в одной пробирке (мастер - микс): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (М1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / I ^E (MHCII) (М5 / 114,152), ПЭ CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) до конечной концентрации 2,5 мкг / мл в буфере FACS , содержащих 10 мкг / мл Fc блока CD16 / CD32 антитело.
      Примечание: Этот набор антител полезен для идентификации и оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов и дендритных клеток.
   4. Добавляют 100 мкл разбавленных антител (мастер-смесь) до лунки V-дно 96-луночного планшета и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
   5. Центрифуга пластину для осаждения клеток и удаления надосадочной жидкости, как в 5.2.2. Промыть клетки с 200 мкл буфера FACS, центрифуге при 500 г в течение 5 мин. Удалить супернатант, как в 5.2.2. и ресуспендирования клеток в 200 мкл PBS.
   6. Центрифуга пластину для осаждения клеток и добавить жизнеспособность красителя, разбавленного в PBS (1: 1000). Инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С.
   7. Центрифуга пластину, чтобы осадить клетки и удалить супернатант, как в 5.2.2. Промыть 200 мкл PBS и центрифугировать планшет снова.
   8. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1% параформальдегидом и хранят при температуре 4 ° С до приобретения FACS инструмента. До переноса сбора суспензии клеток к полипропилену FACS труб.

6. Анализ FACS данных: Gating Стратегии и идентификация клеточных субпопуляциях

1. Выполнить анализ FACS , как сообщалось ранее ^10. Gate приобрела клеток / события, основанные на прогнозных (FSC) и бокового разброса (SSC); а затем ворота жить и CD45 ⁺ клетки. Для альвеолярного макрофага идентификации, ворота CD11b-отрицательные , а затем CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ клеток. (Рисунок 5А).

Результаты

Инъекции опухолевых клеток 4T1-GFP в молочной жировой ткани приводит к образованию опухолей мышей (Рисунок 1А) , что Повторим метастазирования рака молочной железы человека, так как метастазы быстро образуются в легких (рисунок 2), печень, кости и мозг мы?...

Обсуждение

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP