乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

要約

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

要約

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

概要

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

プロトコル

すべての動物実験は、テキサス工科大学健康科学センターの施設内動物管理使用委員会によって承認され、国立衛生研究所発行の「実験動物の管理と使用に関する指針」で概説ガイドラインに従っています。市販されている8〜12週齢の雌のBALB / cマウスを使用してください。乳腺脂肪パッドに、さまざまなベンダーから購入することができGFPを発現する1×10 ⁵の4T1または1×10 ⁵ 4T1細胞を、注入します。

1. 4T1の文化と4T1-GFP細胞＆注射¹⁴のための腫瘍細胞懸濁液の調製

1. 4T1および4T1-GFP細胞培養
   注：特に指定のない限り層流（LAF）バイオ安全キャビネット内で無菌溶液を使用して、すべての手順を実行します。
   1. 10％熱不活性化ウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリンを補充したRPMI培地中で4T1および4T1-GFP細胞を維持しますGおよび100μg/ mlの硫酸ストレプトマイシン。
      注：セルのすべてのトリプシン処理およびメッキをカウントすることにより、通過回数を決定します。通路の数は、細胞の腫瘍形成能および転移能に影響を与えるように、すべてのマウス実験と同一の継代数で細胞を使用することが重要です。
   2. 細胞注射の前には、インキュベーターと吸引媒体から、80％の集密度で腫瘍細胞を含む、T75 cm ²のフラスコを削除します。 10mlのPBSを加え、残りの培地を洗い流すために静かにフラスコを回転させ、その後、PBSを吸引除去します。
   3. フラスコにEDTAを0.25％トリプシンの2ミリリットルを追加し、表面に溶液を均一に分配し、5％CO ₂で37℃で3分間、加湿インキュベーターでインキュベートすることを傾けます。
   4. 細胞の剥離を容易にし、新鮮な培地の8ミリリットルを追加するためのフラスコをタップします。塊を破壊し、単一細胞懸濁液を得るためにアップピペットで上下に数回。
   5. 5分間遠心分離した細胞。室温で500×gで。上清を吸引除去し、PBS 10mlに細胞を洗浄。
   6. 塊を破壊し、単一細胞懸濁液を得るためにアップピペットで上下に数回。 100μlの細胞懸濁液を取り、製造業者の指示に従って細胞生存率分析装置を用いて細胞数を計測します。
   7. 実験に用いたマウスのマウスのx＃当たり10 ⁵細胞（常に安全側になるように余分な細胞を調製）式を用いて全ての注射のために必要な細胞の数を計算します。
   8. 1.1.5のように遠心分離した細胞。 1×10 ⁶細胞/ mlの最終細胞濃度を得るために必要な新鮮なPBSの量の吸引および再懸濁細胞を介して上清を除去します。注射の準備ができるまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
2. 4T1または4T1-GFP細胞注入マウスの手順
   1. 腫瘍細胞注射の前日に、3％イソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔します。マウスは眠っていると定期的に呼吸したら、場所のトン彼ノーズコーンの内側鼻手術用パッドの上にマウス、およびイソフルラン気化器に接続します。 2.5％イソフルランで麻酔を維持します。マウスを麻酔されていることを確認するために、マウスのつま先ピンチ。
   2. 綿棒を使用して脱毛クリームは、注射部位（右胸の乳房脂肪パッド）に適用され、2分間待ちます。湿ったペーパータオルを使用してサイトを清掃し、バックケージにマウスを置くと、それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。
   3. 注射の日に、1.2.2のようにマウスを麻酔し、手術用パッドの上に置きます。
   4. 均一な細胞懸濁液を得るために、腫瘍細胞を含むチューブをボルテックス。吸引0.5 mlのインスリン注射器中に1×10 ⁵個の腫瘍細胞を含有する100μlの細胞懸濁液（29 G 12.7 mmの針の長さ）。
   5. mammarに注射器の針を挿入し、第²および^第3ニップルの近くに親指と指のインデックスを使用して皮膚を持ち上げちょうど指の間の皮膚の下の第三の乳首下記yの脂肪パッドとバブル（皮下注射）を形成するために、ゆっくりと細胞を注入します。
   6. 注射の後に戻ってケージにマウスを置き、1.2.2のように監視します。
3. 腫瘍増殖のモニタリング
   1. キャリパー測定¹⁴
      注：注入された4T1または4T1-GFP細胞が攻撃的な乳房の腫瘍を形成します。細胞接種後の5 - 通常触知可能な腫瘍は、4日目〜表示されます。 4T1-GFP細胞が遅く成長し、後に転移を与える腫瘍を形成します。腫瘍を2〜3回、週を測定します。動物の臨床状態が悪化した場合、動物は、腫瘍が体重の10％を超えるか、直ちにマウスを安楽死、潰瘍になり、10％以上の体重を失います。
      1. 、。1.2.1のように、マウスを麻酔量る、手術用パッドの上に置き、70％エタノールでエリアを濡らします。
      2. （ - 5日細胞接種後4）注射部位に腫瘍を触診します。
      <李>はキャリパーと最大直径（D）およびより小さい直径（D1）を測定します。
      3. 式：体積=（DX D1のXさd1）/ 2 ^から3mmを用いて腫瘍体積を計算します。 1.2.2のように麻酔からのマウスの回復を監視します。
   2. イメージング（のみのための4T1 GFP細胞）
      1. 1.2.1のように、マウスを麻酔。撮像装置内部の可動ステージ上にマウスを置きます。ノーズコーンを介して麻酔を維持します。
      2. 撮像装置および製造者の指示に従ってなどの光源をオンにします。
      3. タブ「取得」の「照明」に移動し、白色光のための空の位置（フィルタなし）に切り替えます。光エンジンがONになっていることを確認し、ライトテーブルに「トランス」を選択します。
      4. タブ「顕微鏡」の下で、「クリア」発光フィルターと0.5Xの倍率を選択します。 「カメラ」タブでは、捕獲用のビニングは「1×1」とプレビュー」は、4×4」であることを確認してください。
      5. 鮮明な画像を得るために焦点を当てて、白色光に腫瘍を見つけるために、プレビューをクリックし、キャプチャをクリックします。
      6. 1（製造者の指示に従って、GFP用のフィルタ）をフィルタリングする「取得」タブと変化照明に移動します。 「マイクロスコープ」タブで、「20分の530のGF」に発光フィルターを変更します。緑チャンネルで画像をプレビューし、キャプチャします。適切な明るさを得るために、露光時間を調整します。
      7. 画像に疑似カラーを適用し、適切なフォルダ（ 図1）に保存します。

リポソーム¹⁰の2鼻腔内投与

注：特に指定のない限り層流（LAF）バイオ安全キャビネット内で無菌溶液を使用して、すべての手順を実行します。

1. 腫瘍細胞の注射後6日目に1.2.1のようにマウスを麻酔。
2. メーカーから入手したクロドロネートまたは対照（PBS）リポソーム懸濁液をVORTEX。 60μlのリポソーム秒を取りますuspensionは、滅菌ピペットチップを用いて。
3. ゆっくりと、マウスが溶液中で呼吸することを可能にする鼻孔近く（5μlのたびに）リポソーム溶液を解放を60μlの全用量が投与されるまで繰り返します。
4. マウスはケージに戻ってそれを配置する前に意識を取り戻すしてみましょう。
5. マウスを屠殺されるまで、3日ごとリポソーム投与を繰り返します。犠牲の日にリポソームを投与しないでください。

3.マウスの犠牲とティッシュコレクション

注：マウスの​​解剖のためにオートクレーブし、滅菌器具を使用してください。一方、重要な臓器の放血および削除により麻酔下でマウスを安楽死させます。

1. 22日目 腫瘍細胞注射は1.2.1で、マウスを麻酔した後（4T1-GFP細胞について）または26日目（4T1細胞）。および1.2.1のように麻酔を維持し、気化器に接続されたノーズコーンと外科手術パッドの上に置きます。メートルことを保証するために、足の指の1ピンチウーズは無意識です。
2. 解剖ボードに針を使用して、つま先をピン。マウスの皮膚にエタノールをスプレーします。
3. 鉗子を用いて皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで切開を行います。ゆっくりと腹膜を露出させ、首まで胸部を通って皮膚を切断続けます。
4. 手術用はさみを使用すると、腹膜の切開を行い、血管への損傷を避ける綿のヒントを慎重に臓器を公開します。
5. 片側に臓器を移動し、下大静脈を露出させます。静脈を穿刺し、29 Gインスリン注射器で血液を採取。チューブに採取した血液を置き、さらなる処理のために氷の上に残します。
6. 胸郭、肺と心臓を露出させるために、振動板をカット。ゆっくりと骨のカッターを使用して、両側の胸郭をカットし、胸郭の上部を持ち上げます。鉗子で心をつかみ、胸腔に心臓や肺をつなぐ結合組織を切断します。
7. 60ミリメートルに少量のPBSで肺を置きます【ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色を含む]イメージングおよび免疫蛍光顕微鏡またはルーチン組織学のために凍結切片への更なる処理のための直前まで、氷上でペトリ皿。

4.肺転移の評価

1. 表面転移を数えると採点
   1. 解剖顕微鏡下で肺とペトリ皿を置きます。肺表面のクリアな視界を得るために焦点を当てています。
   2. 解剖顕微鏡を使用すると、肺表面を観察します。両肺の前部と後部の両側に転移を数えます。
      注：正常な肺は白っぽいまたはピンクがかったし、多孔質であり、構造のようなスポンジを持っています。 4T1転移は時々液体の滴（ 図2A）と類似していると思われる、固体及び非多孔性です。
2. 肺イメージング
   1. 撮像装置内部の可動ステージ上の肺とペトリ皿を置きます。
   2. 楽器をオンにし、マルチスペクトルソースをbiolite。ソフトウェアを開きます。タブの下で、「取得」は、「照明」に進んで、白色光のための空の位置（フィルタなし）に切り替えます。ライトエンジン - > ON、ライトテーブル - >エピ。タブ「顕微鏡」の下で「クリア」発光フィルターと1.66X倍率を選択します。 「カメラ」タブでは、捕獲用のビニングは「1×1」とプレビュー」は、4×4」であることを確認してください。
   3. プレビューをクリックして、白色光で肺の鮮明な画像を取得し、キャプチャをクリックして焦点を合わせます。
   4. 「取得」タブに移動し、フィルタ1（製造者の指示に従って、GFP用フィルター）に変更します。 「マイクロスコープ」タブで、「20分の530のGF」に発光フィルターを変更します。緑チャンネルで画像をプレビューし、キャプチャします。適切な明るさを得るために、露光時間を調整します。
   5. 画像に疑似カラーを適用し、適切なフォルダに保存します。
   6. 同様の方法で、反対側の画像を取得するために、肺を反転します。このPROCedureはさらに、適切なソフトウェア（ 図^{2B）14 を}使用して定量化することができるGFP陽性転移の画像を生成します。
3. 免疫蛍光顕微鏡
   1. 暗所で4時間、4℃で、4％パラホルムアルデヒドで肺を修正しました。
   2. 完全に固定液を除去するために、5分間10ミリリットルPBSで2回組織を洗ってください。 PBS中の18％スクロースに移し、4℃でO / Nインキュベートします。
   3. スクロースから組織を除去し、余分をオフに軽くたたきます。
   4. cryomoldを取り、10月媒体と底層をカバーしています。 10月培地上の組織を配置します。完全にドライアイス上の組織と場所をカバーするために10月培地で金型を埋めます。
   5. 切片まで-80℃で保存ブロック。
   6. 帯電したスライド上クライオスタットと場所で厚さ5μmの切片を作製。
   7. さらに使用するまで-80℃で未使用のスライドを保管してください。
   8. 空気は7分間スライドを乾燥させます。そして、10月を除去するためにPBSで洗浄しました。 WIP電子ティッシュや紙タオルでスライドは、過剰の水を除去し、DAPIを含む封入剤でカバースリップをマウントし、顕微鏡下でGFPフィルターを用いて可視化します。
   9. 適切なソフトウェア¹⁴を使用して（ 図3A）GFP転移を定量化します。
4. 組織学およびデジタル病理
   1. スタートタブで手動ロード]ボタンをクリックし、スキャナから排出するために、ラックを保持するスライドを待ちます。
   2. 、H＆E染色された組織切片を取る任意の汚れを除去するために、組織とそれをきれいにし、スライド保持ラックにしっかり入れてください。
   3. ポップアップウィンドウで、スライドの説明を入力します。
   4. SSイメージングコンソールウィンドウにスキャン領域]タブを選択し、スキャンされる関心領域（ROI）を定義するために、緑色の四角形を調整します。
   5. ROI内で、しかし、組織が存在しないスライドの明確な部分に青色のキャリブレーションダイヤモンドをドラッグします。
   6. 次に、焦点Pを選択タブointsとROI内の組織上のいくつかのフォーカスポイント（黄色のプラス記号）を取得するために、自動選択ボタンをクリックします。
   7. 必要に応じて、ROI内をダブルクリックして、手動で追加のフォーカスポイントを配置します。
   8. 校正]タブに進み、青いキャリブレーションダイヤモンドポイントでスライドキャリブレーションを開始するためにキャリブレーション]ボタンを選択します。キャリブレーションが完了した後、キャリブレーションポイントの画像が表示されます。
   9. それを明確にし、汚れやアーチファクトの自由であることを保証するために、このイメージを点検します。
   10. [スキャン]タブに進み、ROIのスキャンを開始するには、[開始スキャン]を選択します。スキャンされた組織切片は、デジタルスライドに変換される（ 図3Bおよび4A）
   11. 先に説明した（ 図^4B）14のような転移性の負担を定量化します。

肺における肺胞マクロファージの5フローサイトメトリー（FACS）分析

1. 単一細胞の調製Suspensiに
   1. イメージングおよび転移の計数した後、滅菌PBSで肺を洗浄し、ペトリ皿に置きます。手術用ハサミとピンセットを用いて、肺の2ミリメートルの部分 - 1を加えます。
   2. 1mg / mlのコラゲナーゼPを含む消化緩衝液3mlで15ミリリットルコニカルチューブに肺片を転送し、0.04mg / mlのDNアーゼI、および10μg/ mlのトリプシンを溶解RPMI培地（滅菌）を阻害します。
   3. 40分間37℃のインキュベーター内で回転シェーカー上のコニカルチューブをインキュベートします。
   4. インキュベーターからチューブ円錐形を削除し、組織を解離するには、上下ソリューションをピペット。
   5. 塊を回避し、単一細胞懸濁液を得るために40μmのストレーナーを通して溶液を渡します。必要に応じて、シリンジプランジャの助けを借りて、セルストレーナーに対してより優れた消化された組織プレス組織を崩壊します。
   6. 単一細胞懸濁液が達成されたときに、遠心分離によって細胞を採取して赤血球を溶解RTで10分間ACK緩衝液を2ml。その後、RPMIの8ミリリットルでペレットを2回洗浄します。
   7. 完全RPMI培地3mlとで再懸濁した細胞を、製造業者の説明書に従って、細胞生存率分析器を用いて計数するセルに進みます。
2. 表面マーカーのための肺細胞の染色
   注：4℃で全てのインキュベーションを行います。 500×gで、4℃で遠心分離プレート。
   1. ピペットV底96ウェルプレートの個々のウェルのFACS緩衝液（PBS中の1％FBS）100μl中1×10 ⁶細胞。 V底96ウェルプレートを使用して複数のサンプルの取り扱いを容易にします。
   2. プレインキュベート1μgのマウスFcブロックで細胞懸濁液を15分間、FACS緩衝液100μl中の抗マウスCD16 / CD32精製しました。遠心して細胞をペレット化し、プレートを反転し、液排出をさせることにより、上清を除去するためのV底96ウェルプレート。
   3. 表面染色のために、事前に、ムリンに対する抗体を希釈1管（マスターミックス）での電子の抗原：BV605 CD45（30-F11）、PEのCD11b（M1 / 70）、PE / Cy7のF4 / 80（BM8）、APC / Cy7のCD11cの（N418）、PerCPCy5.5 I ^A / I ^{E（MHCII）（M5} / 114.152）、PE CD80（16-10A1）、AF 647 CD86（GL-1）のFcブロックCD16 / CD32を10μg/ mlを含むFACS緩衝液中に2.5μgの/ mlの最終濃度に抗体。
      注：抗体のこのセットは、識別し、肺胞マクロファージや樹状細胞の機能状態を評価するために有用です。
   4. V底96ウェルプレートのウェルに希釈した抗体（マスターミックス）の100μlを添加して、30分間、4℃でインキュベートします。
   5. 細胞をペレット化し、5.2.2のように、上清を除去するために、プレートを遠心します。 FACS緩衝液200μl、5分間500グラムで遠心分離で細胞を洗浄。 5.2.2のように上清を取り除きます。そして200μlのPBSで細胞を懸濁します。
   6. 遠心して細胞をペレット化し、PBS（1：1,000）で希釈した生存性色素を追加するためのプレート。 4℃で20分間インキュベートします。
   7. 細胞をペレット化し、5.2.2のように上清を除去し、プレートを遠心。 200μlのPBSで洗浄し、再びプレートを遠心します。
   8. FACS装置により取得するまで4℃で1％パラホルムアルデヒドや店舗の100μl中に再懸濁細胞。ポリプロピレンFACSチューブに収集転送細胞懸濁液に先立っ。

6. FACSデータの解析：ゲーティング戦略と細胞亜集団の同定

1. 以前に^10を報告したように、FACS分析を実行します。前方（FSC）および側方散乱（SSC）に基づいてゲート取得細胞/イベント。そして、ライブゲートおよびCD45 ⁺細胞。肺胞マクロファージの識別、ゲートのCD11b陰性、その後のCD11c ⁺ F4 / 80 ⁺細胞について。 （ 図5A）。

結果

転移は、急速に肺（ 図2）、肝臓、骨に形成されているように乳房脂肪パッドに4T1-GFP腫瘍細胞の注射は、ヒト乳癌の転移拡散を再現マウス腫瘍（ 図1A）の形成をもたらしますマウス¹¹の脳。 GFPと4T1細胞の安定なトランスフェクションは、腫瘍増殖のモニタリングを容易にする（ 図1B）、転移腫瘍細胞を追跡し、転移性の?...

ディスカッション

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP