L'étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

Résumé

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Résumé

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Introduction

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells^1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil^1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed.

Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood⁸. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens⁹. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses¹⁰.

For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer¹¹; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche⁶. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies¹². To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells¹³; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation¹⁰.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l'utilisation Comité du Texas Tech University Health Sciences Center et suivi les lignes directrices énoncées dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire», publié par les National Institutes of Health. Utiliser huit à douze semaines vieilles souris BALB / c femelles qui sont disponibles dans le commerce. Injecter 1 x 10 ⁵ 4T1 ou 1 x 10 ⁵ 4T1 cellules exprimant la GFP, qui peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, dans le coussinet adipeux mammaire.

1. Culture de 4T1 et 4T1-GFP cellules et préparation des cellules tumorales Suspension Injections ¹⁴

1. 4T1 et 4T1-GFP Culture cellulaire
   REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l'aide des solutions stériles dans un flux d'air laminaire (LAF) armoire bio-sécurité, sauf indication contraire.
   1. Maintenir les cellules 4T1 et 4T1-GFP dans du milieu RPMI additionné de 10% de sérum bovin foetal inactivé à la chaleur et 100 U / ml de pénicillineG et 100 ug / ml de sulfate de streptomycine.
      REMARQUE: Déterminer un numéro de passage en comptant tous les trypsinisation et le placage des cellules. Il est important d'utiliser des cellules ayant le même nombre de passages pour toutes les expériences de la souris, comme le nombre de passages affecte la tumorigénicité des cellules et le potentiel métastatique.
   2. Avant les injections de cellules retirer le flacon T75 cm ^2, contenant des cellules tumorales à 80% de confluence, à partir d' un support d'incubateur et aspirer. Ajouter 10 ml de PBS et faire tourner le flacon doucement pour laver restante moyenne, puis aspirer PBS.
   3. Ajouter 2 ml de 0,25% de trypsine avec de l' EDTA dans le flacon et l' incliner pour distribuer la solution uniformément sur ​​la surface et incuber dans un incubateur humidifié pendant 3 min à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   4. Appuyez sur le flacon pour faciliter le détachement des cellules et ajouter 8 ml de milieu frais. Pipette monter et descendre plusieurs fois pour perturber des touffes et obtenir une suspension cellulaire unique.
   5. Centrifuger les cellules pendant 5 min. à 500 g à température ambiante.Aspirer le surnageant et laver les cellules dans 10 ml de PBS.
   6. Pipette monter et descendre plusieurs fois pour perturber des touffes et obtenir une suspension cellulaire unique. Prendre 100 ul d'une suspension de cellules et compter les cellules en utilisant l'analyseur de la viabilité des cellules selon les instructions du fabricant.
   7. Calculer le nombre de cellules nécessaires pour toutes les injections en utilisant la formule: 10 ⁵ cellules par souris x nombre de souris utilisées dans une expérience (toujours préparer des cellules supplémentaires pour être sur un côté sûr).
   8. Centrifuger les cellules comme dans 1.1.5. Enlever le surnageant par aspiration des cellules et remettre en suspension dans la quantité de PBS frais nécessaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Gardez la suspension de cellules sur la glace jusqu'au moment de l'injection.
2. Procédures souris par injection ou cellules 4T1 4T1-GFP
   1. Le jour avant l'injection des cellules tumorales, anesthésier les souris dans une chambre d'induction avec 3% d'isoflurane. Une fois que les souris dorment et respirent régulièrement, endroit til la souris sur un bloc opératoire avec le nez à l'intérieur du cône de nez, et le connecter au vaporisateur isoflurane. Maintenir l'anesthésie avec 2,5% d'isoflurane. Pincez le bout de la souris pour veiller à ce que la souris est anesthésiée.
   2. Appliquer la crème d'épilation à l'aide d'un coton-tige sur le site d'injection (à droite de coussinet adipeux mammaire pectoral) et attendre 2 min. Nettoyer le site à l'aide d'une serviette en papier humide, placer la souris dans la cage et surveiller un animal jusqu'à ce qu'il reprenne conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternale.
   3. Le jour de l'injection, anesthésier les souris comme en 1.2.2 et placer sur le tampon chirurgical.
   4. Vortexer le tube contenant les cellules tumorales pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Aspirer 100 ul d'une suspension cellulaire contenant 1 x 10 cellules ⁵ tumorales, dans une seringue d' insuline de 0,5 ml (29 g, 12,7 mm de longueur à l' aiguille).
   5. Soulever la peau à l' aide de l'indice de pouce et à proximité de la 2 ^e et 3 ^e mamelon, insérer l'aiguille de la seringue dans le Mammary coussinet adipeux juste en dessous du troisième mamelon sous la peau entre les doigts et injecter les cellules lentement pour former une bulle (injection sous-cutanée).
   6. Placez la souris dans la cage après l'injection et surveiller comme dans 1.2.2.
3. Surveiller la croissance de la tumeur
   1. Mesures Caliper ¹⁴
      NOTE: les cellules 4T1 Injecté ou 4T1-GFP forment une tumeur du sein agressif. Habituellement, les tumeurs palpables apparaissent ~ au jour 4 - 5 après l'inoculation des cellules. les cellules 4T1-GFP forment des tumeurs qui se développent plus lentement et donnent des métastases plus tard. Mesurer la tumeur deux à trois fois par semaine. Si l'état clinique des animaux se détériore, les animaux perdent plus de 10% du poids corporel, les tumeurs dépassent 10% du poids corporel ou deviennent ulcérées, euthanasier les souris immédiatement.
      1. Anesthetize une souris comme dans 1.2.1., Peser, place sur le pad chirurgical et mouiller la zone avec 70% d'éthanol.
      2. Palper une tumeur au site d'injection (4 - 5 jours après l'inoculation des cellules).
      3. Mesurer le diamètre le plus grand (D) et le plus petit diamètre (d1) avec un pied à coulisse.
      4. Calculer le volume de la tumeur en utilisant la formule Volume = (DX X d1 d1) / 2 mm ^3. Assurer le suivi de la souris de l'anesthésie comme dans 1.2.2.
   2. Imaging (Uniquement pour 4T1 cellules GFP)
      1. Anesthetize la souris comme dans 1.2.1. Placez la souris sur une scène mobile à l'intérieur de l'instrument d'imagerie. Maintenir l'anesthésie à travers le cône de nez.
      2. Allumez l'instrument d'imagerie et de la source de lumière selon les instructions du fabricant.
      3. Sous l'onglet "Acquisition" go to "Lighting" et passer à la position vide (pas de filtre) pour la lumière blanche. Assurez-vous que le moteur est allumé et sélectionnez 'Trans' dans la table lumineuse.
      4. Sous l'onglet "Microscope", sélectionnez "Effacer" filtre d'émission et 0.5X grossissement. Dans l'onglet "Caméra", assurez-vous que binning pour la capture est '1 x 1' et l '4 x 4'.
      5. Cliquez sur l'aperçu pour localiser la tumeur dans la lumière blanche, se concentrer pour obtenir une image claire, et cliquez sur la capture.
      6. Allez à l'onglet et le changement d'éclairage "Acquisition" pour filtrer 1 (filtre pour GFP selon les instructions du fabricant). Dans l'onglet "Microscope", changer le filtre d'émission à "GF 530/20". Aperçu et de capture d'image dans un canal vert. Réglez le temps d'exposition pour obtenir la luminosité appropriée.
      7. Appliquer pseudocolor à l'image et l' enregistrer dans le dossier approprié (Figure 1).

2. intranasale administration de Liposomes ¹⁰

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l'aide des solutions stériles dans un flux d'air laminaire (LAF) du cabinet Bio-sécurité, sauf indication contraire.

1. Au jour 6 après l'injection des cellules tumorales anesthésier les souris comme au point 1.2.1.
2. Vortex la suspension de clodronate ou le contrôle (PBS) liposome obtenu auprès du fabricant. Prendre 60 pl liposome sUSPENSION en utilisant la pointe de pipette stérile.
3. Relâchez doucement la solution de liposome (5 pi à chaque fois) à proximité des narines permettant la souris de respirer dans la solution, répéter jusqu'à ce que la totalité de la dose de 60 ul est administré.
4. Laissez la souris reprendre conscience avant de le remettre dans la cage.
5. l'administration de liposomes répétition tous les 3 jours jusqu'à ce que les souris sont sacrifiées. Ne pas administrer des liposomes un jour de sacrifice.

3. Sacrifice souris et Collection de tissus

REMARQUE: Utilisez autoclavé et instruments stériles pour la dissection de la souris. Euthanasier souris sous anesthésie par l'exsanguination et le retrait des organes vitaux.

1. Au jour 22 (Pour les cellules 4T1) ou 26 jours (pour les cellules 4T1-GFP) après l'injection de cellules tumorales anesthésier la souris comme au point 1.2.1. et placer sur le pad chirurgical avec un cône de nez relié à freezer, maintenir l'anesthésie comme dans 1.2.1. Pincer une des orteils pour faire en sorte que la mouse est inconscient.
2. Epingler les orteils à l'aide d'aiguilles à la planche à dissection. Pulvériser l'éthanol sur la peau de la souris.
3. Soulever la peau à l'aide de pinces et faire une incision avec les ciseaux chirurgicaux. Lentement exposer le péritoine et continuer à réduire la peau à travers le thorax jusqu'à ce que le cou.
4. À l'aide des ciseaux chirurgicaux faire une incision dans le péritoine et exposer soigneusement les organes avec des conseils de coton en évitant d'endommager les vaisseaux sanguins.
5. Déplacer les organes d'un côté et d'exposer la veine cave inférieure. Piquer la veine et recueillir le sang avec le 29 G seringue à insuline. Placez le sang collecté dans le tube et laisser sur la glace pour un traitement ultérieur.
6. Couper la membrane pour exposer les côtes cage, les poumons et le cœur. Lentement couper la cage thoracique des deux côtés à l'aide de l'outil de coupe d'os et de soulever la partie supérieure de la cage thoracique. Prenez le cœur avec une pince et couper le tissu conjonctif reliant le cœur et les poumons à la cavité thoracique.
7. Placez les poumons en petite quantité de PBS dans le 60 mmboîte de Pétri sur de la glace jusqu'à ce prêt pour l'imagerie et le traitement ultérieur à des coupes congelées pour la microscopie par immunofluorescence ou histologie de routine [y compris l'hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration].

4. Lung évaluation Métastases

1. Comptage et Scoring Métastases Surface
   1. Placez la boîte de Pétri avec les poumons sous le microscope de dissection. Concentrez pour obtenir une vue claire de la surface du poumon.
   2. En utilisant un microscope de dissection, d'observer la surface du poumon. Comptez métastases sur les côtés antérieur et postérieur des deux poumons.
      NOTE: Le poumon normal est blanchâtre ou rosâtre et poreuse et a une structure spongieuse. Métastases 4T1 sont solides et non poreux, semblent parfois être semblable à une goutte de liquide (figure 2A).
2. imagerie pulmonaire
   1. Placer la boîte de Petri avec des poumons à la platine mobile à l'intérieur de l'appareil d'imagerie.
   2. Allumez l'instrument et labiolite la source multispectral. Ouvrez le logiciel. Sous l'onglet "Acquisition", allez dans "éclairage", et passer à la position vide (pas de filtre) pour la lumière blanche. Light Engine -> ON, table Light -> Epi. Dans le cadre du "Microscope" tab Sélectionnez 'Clear' filtre d'émission et 1,66x grossissement. Dans l'onglet "Caméra", assurez-vous que binning pour la capture est '1 x 1' et l '4 x 4'.
   3. Cliquez sur l'aperçu et de se concentrer pour obtenir une image claire des poumons en lumière blanche et cliquez sur la capture.
   4. Allez à l'onglet "Acquisition" et le changement du filtre 1 (filtre pour GFP selon les instructions du fabricant). Dans l'onglet "Microscope", changer le filtre d'émission à "GF 530/20". Aperçu et de capture d'image dans un canal vert. Réglez le temps d'exposition pour obtenir la luminosité appropriée.
   5. Appliquer pseudocolor à l'image et l'enregistrer dans le dossier approprié.
   6. Retournez les poumons pour obtenir l'image de l'autre côté de la même manière. Ce procedure génère des images de métastases GFP-positives qui peuvent encore être quantifiés en utilisant un logiciel approprié (figure 2B) ^14.
3. immunofluorescence Microscopie
   1. Fixer les poumons dans 4% de paraformaldehyde, à 4 ° C pendant 4 heures dans l'obscurité.
   2. Laver le tissu deux fois avec 10 ml de PBS pendant 5 minutes pour éliminer complètement le fixateur. Transfert à 18% de saccharose dans du PBS et incuber O / N à 4 ° C.
   3. Retirez le tissu du saccharose et tamponner tout excès.
   4. Prenez un cryomoule, recouvrir la couche de fond avec le milieu octobre Placez le tissu sur le milieu octobre Remplissez le moule avec un milieu OPO pour couvrir complètement le tissu et le placer sur la glace sèche.
   5. bloc de magasin à -80 ° C jusqu'à sectionner.
   6. Préparer 5 um sections épaisses avec un cryostat et lieu sur des lames chargées.
   7. Stocker les diapositives inutilisés -80 ° C jusqu'à son utilisation ultérieure.
   8. Air sécher les lames pendant 7 min. et laver avec du PBS pour éliminer octobre Wipe la lame avec un tissu ou une serviette en papier pour enlever l'excès d'eau, monter des lamelles avec un milieu contenant DAPI de montage et de visualiser avec filtre GFP sous microscope.
   9. Quantifier métastases GFP (Figure 3A) avec l'utilisation d' un logiciel approprié ^14.
4. Histologie et de pathologie numérique
   1. Cliquez sur le bouton manuel de charge sous l'onglet de démarrage et d'attendre la glissière de maintien en rack pour éjecter du scanner.
   2. Prenez la section de tissu H & E taché, nettoyez-le avec un tissu pour enlever la saleté, et placez-le dans le rack de maintien de diapositive.
   3. Entrez la description de diapositives dans la fenêtre sauté-up.
   4. Sélectionnez l'onglet Zone de numérisation sur la fenêtre de la console d'imagerie SS et ajuster le carré vert pour définir la région d'intérêt (ROI) à numériser.
   5. Faites glisser le calibrage diamant bleu à une partie claire de la diapositive, où le tissu est absent, cependant, dans le ROI.
   6. Ensuite, sélectionnez le point Points onglet et cliquez sur le bouton de sélection automatique pour obtenir plusieurs points de discussion (des signes plus jaunes) sur le tissu dans le ROI.
   7. Si nécessaire, placer des points de discussion supplémentaires manuellement en double-cliquant dans le ROI.
   8. Passez à l'onglet d'étalonnage et sélectionnez le bouton d'étalonnage pour commencer l'étalonnage de glissement au niveau du point d'étalonnage de diamant bleu. Après la calibration est terminée, l'image à partir du point d'étalonnage sera affiché.
   9. Inspecter cette image pour vous assurer qu'il est clair et exempt de saleté ou des artefacts.
   10. Passez à l'onglet Analyse et sélectionnez Démarrer Numériser pour lancer la numérisation du ROI. Coupe histologique scannée est converti en un diaporama numérique (figure 3B et 4A)
   11. Quantifier le fardeau métastatique comme décrit précédemment (figure 4B) ^14.

5. cytométrie de flux (FACS) Analyse des macrophages alvéolaires dans les poumons

1. Préparation de la cellule unique suspensisur
   1. Après l'imagerie et le comptage des métastases, se laver les poumons avec du PBS stérile et placer la boîte de Pétri. Faire 1 - 2 mm pièces des poumons à l'aide de ciseaux et des pinces chirurgicales.
   2. Transférer les morceaux de poumon au tube de 15 ml conique avec 3 ml de tampon de digestion contenant 1 mg / ml de collagénase P, 0,04 mg / ml de désoxyribonucléase I, et 10 ug ml de milieu / inhibiteur de la trypsine dissoute RPMI (stérile).
   3. Incuber le tube conique sur un agitateur rotatif à l'étuve à 37 ° C pendant 40 min.
   4. Retirez le tube conique de l'incubateur et la pipette la solution de haut en bas pour dissocier le tissu.
   5. Faire passer la solution à travers le tamis de 40 um pour éviter des touffes et d'obtenir une suspension cellulaire unique. Si besoin est, pour désintégrer mieux le tissu de presse de tissu digéré contre le tamis cellulaire à l'aide d'un piston de seringue.
   6. Quand une suspension cellulaire unique a été obtenue, recueillir les cellules par centrifugation et lyser les globules rouges avec2 ml de tampon ACK pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, lavez une pastille à deux reprises dans 8 ml de RPMI.
   7. Resuspendre les cellules dans 3 ml du milieu RPMI complet et procéder à la cellule de comptage en utilisant l'analyseur de la viabilité des cellules selon les instructions du fabricant.
2. Coloration des cellules pulmonaires pour les marqueurs de surface
   REMARQUE: Effectuer toutes les incubations à 4 ° C. plaque Centrifugeuse à 500 g et 4 ° C.
   1. Introduire à la pipette 1 x 10 ⁶ cellules dans 100 ul de tampon FACS (1% de FBS dans du PBS) à des puits individuels d'une plaque à 96 puits à fond en V. L'utilisation d'une plaque à 96 puits de fond en V facilite la remise d'échantillons multiples.
   2. Pré-incuber la suspension de cellules avec 1 pg de Fc de souris purifié Bloc anti-souris CD16 / CD32 dans 100 ul de tampon FACS pendant 15 min. Centrifuger la plaque à 96 puits de fond en V pour sédimenter les cellules et éliminer le surnageant en retournant la plaque et laisser le drain de la solution.
   3. Pour la coloration de surface, à l'avance, à diluer les anticorps murinse antigènes dans un tube (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I ^A / I ^E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) jusqu'à une concentration finale de 2,5 pg / ml dans un tampon FACS contenant 10 pg / ml de Fc bloc CD16 / CD32 anticorps.
      REMARQUE: L'ensemble de ces anticorps est utile pour l'identification et l'évaluation d'un état fonctionnel des macrophages alvéolaires et des cellules dendritiques.
   4. Ajouter 100 ul d'anticorps dilué (master mix) aux puits de la plaque de 96 puits de fond en V et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
   5. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et retirer le surnageant comme en 5.2.2. Laver les cellules avec 200 pi de tampon FACS, centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirer le surnageant comme en 5.2.2. et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS.
   6. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et ajouter la viabilité colorant dilué dans du PBS (1: 1000). Incuber pendant 20 min à 4 ° C.
   7. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et retirer le surnageant comme en 5.2.2. Laver avec 200 ul de PBS et centrifuger à nouveau la plaque.
   8. Resuspendre les cellules dans 100 pi de 1% de paraformaldéhyde et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l'acquisition par instrument FACS. Préalablement à des suspensions de cellules de transfert d'acquisition aux tubes en polypropylène FACS.

6. Analyse des données FACS: Stratégies Gating et l'identification des sous-populations cellulaires

1. Effectuer une analyse FACS comme indiqué précédemment ^10. Porte acquis cellules / événements basés sur prospectifs (FSC) et dispersion latérale (SSC); puis la porte en direct et CD45 ⁺ cellules. Pour l' identification des macrophages alvéolaires, porte-CD11b négatives puis CD11c ⁺ F4 / 80 ⁺ cellules. (Figure 5A).

Résultats

L'injection de cellules tumorales 4T1-GFP dans le coussinet adipeux mammaire conduit à la formation de tumeurs de souris (figure 1A) qui récapitulent la propagation métastatique du cancer du sein humain, comme les métastases sont rapidement formées dans les poumons (Figure 2), le foie, les os et le cerveau de souris ^11. La transfection stable de cellules 4T1 avec la GFP facilite la surveillance de la croissance tumorale (figur...

Discussion

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months¹⁵. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4T1 cell line	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL 2539	Tumor cells
4T1-GFP cell line	Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	BW128090	Tumor cells
RPMI	Corning, Corning, NY, USA	10-040-CM	Media
Heat inactivated FBS	Gibco (Thermo Scientific), USA	10082147	Media
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	MT-300-02-CI	Media
PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	BP399-20	Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA	Hyclone, Logan, Utah, USA	SH30042.02	Tissue culture supplies
T75 cm2 flask	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	12-565-32	Tissue culture supplies
15 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352096	Tissue culture supplies
50 ml conical tube	BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA	352098	Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AS4052	For lung imaging
Isoflurane (Isothesia)	Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA	NDC 11695-6776-2	Mouse anesthesia
Clodronate liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101C-N	Macrophages depletion
Control liposomes	Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA	F70101-N	Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On	Walmart, Bentonville, AR, USA		For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair)	Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%)	Affymetrix, Santa Clara, CA, USA	19943-I Lt	Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	230-730-571	For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	17985-51	Mounting medium
Sucrose	Sigma, St. Louis, MO, USA	S-9378	Cryopreservation
Collagenase P	Roche, Basel, Switzerland	11249002001	Components of tissue digestion buffer
Dnase I	Roche, Basel, Switzerland	10104159001	Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor	Sigma, St. Louis, MO, USA	T9253	Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	22-363-547	Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)	Biolegend, San Diego, CA, USA	101320	Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45	Biolegend, San Diego, CA, USA	103139	Antibodies for flow cytometry
PE CD11b	Biolegend, San Diego, CA, USA	101207	Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80	Biolegend, San Diego, CA, USA	123113	Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c	Biolegend, San Diego, CA, USA	117323	Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)	Biolegend, San Diego, CA, USA	107625	Antibodies for flow cytometry
PE CD80	Biolegend, San Diego, CA, USA	104707	Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86	Biolegend, San Diego, CA, USA	105019	Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506	eBioscience, San Diego, CA,USA	65-0866	Antibodies for flow cytometry
Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA	CM1850	Cryosectioning
UVP iBox Explorer	UVP Inc, Upland, CA, USA		Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Digital pathology
BD LSRFortessa	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA		Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)	UVP Inc, Upland, CA, USA		Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA		Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1)	Flow JO LLC, Ashland, OR, USA		Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit	Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.		Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP