JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم استخدام الثقافة الابتدائية الخلايا البطانية القرنية البقري للتحقيق في آلية القرنية الانتقالية البطانية الوسيطة. وعلاوة على ذلك، تم استخدام الفئران بطانة القرنية نموذج cryoinjury لإثبات القرنية الانتقالية البطانية الوسيطة في الجسم الحي.

Abstract

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Introduction

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping1. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis2. When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm2, the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells5, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor6, and contact inhibition2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion14. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protocol

وجاءت جميع الإجراءات في هذه الدراسة يتفق مع جمعية البحوث في الرؤية والعيون بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من مستشفى جامعة تايوان الوطنية.

1. عزل، إعداد الثقافة الابتدائية، والمناعية من الأبقار CECS

  1. الحصول على عيون البقر الطازجة من المسالخ المحلية.
  2. تطهير العيون في 10٪ ث / ت حل بوفيدون اليود لمدة 3 دقائق. غسلها بمحلول ملحي (PBS) حل الفوسفات.
  3. حصاد زر القرنية مع مشرط ومقص تحت ظروف معقمة. غشاء قشر ديسميه مع ملقط تشريح تحت المجهر (لاحظ أن في هذه الدراسة، تم منزوعة النواة عيون الأبقار التي المسالخ المحلية، وبالتالي، كان إجراء الدراسة الأولى لتعقيم عيون preenucleated في المختبر).
  4. احتضان غشاء ديسميه في 1 مل من المحاولةpsin عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جمع CECS البقري عن طريق الطرد المركزي في 112 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في 1 مل من استكمال المتوسطة طلائي الهرموني (شيم) التي تحتوي على كميات متساوية من HEPES مخزنة Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة والمتوسطة F12 هام، وتستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، و 0.5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد، 2 نانوغرام / مل من البشرة الإنسان عامل النمو، 5 ملغ / مل من الانسولين، 5 ملغ / مل من ترانسفيرين، 5 نانوغرام / مل من السيلينيوم، 1 نانومول / لتر من بكتيريا الكوليرا، 50 ملغ / مل الجنتاميسين، و 1.25 ملغ / مل من أمفوتيريسين B.
  5. البذور الخلايا (حوالي 1 × 10 5 خلايا لكل عين) في طبق 6 سم. ثقافة لهم في SHEM. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2 في الهواء. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام.
  6. وعندما تصل خلايا التقاء، غسلها في برنامج تلفزيوني واحتضان لهم في 1 مل من التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. جمعها بواسطة الطرد المركزي في 112 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من SHEM.
    1. عد الخلايا في عدادة الكريات. البذور الخلايا على الشرائح غطاء في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 4 لكل بئر في 24 لوحة جيدا، والثقافة الخلايا في SHEM. للتحقيق في تأثير EnMT-قمع من marimastat، واحتضان الخلايا في SHEM مع 10 ميكرومتر من marimastat إضافتها إلى مستنبت، وتغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام.
  7. إصلاح الخلايا في مرحلة الزمنية المشار إليها مع 250 ميكرولتر من 4٪ لامتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize مع 250 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق. منع مع 10٪ البقري ألبومين المصل لمدة 30 دقيقة.
  8. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية ضد نشط بيتا كاتينين (ABC)، الحلزون، وسبيكة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التخفيف من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي 1: 200. والمخفف الأجسام المضادة في مخفف الأجسام المضادة تتكون من 10 ملي PBS، 1٪ ث / ت زلال المصل البقري، و0.09٪ ث / ت أزيد الصوديوم.
  9. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، واحتضانم مع الأجسام المضادة اليكسا فلور مترافق الثانوية (1: 100 في مخفف الضد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  10. مباين نواة الخلية التي تغطي الخلايا مع 2 ميكروغرام / مل من 4، 6 diamidino-2-phenylindole، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، وجبل لهم مكافحة يتلاشى حل المتصاعدة.
  11. الحصول على صور مناعي في موجات الإثارة من 405 و 488 نانومتر باستخدام ليزر المسح المجهر متحد البؤر مع 20X التكبير موضوعي.

نموذج 2. الجرذ القرنية البطانة Endothelium Cryoinjury وIntracameral حقن

  1. تخدير الفئران الذكور سبراغ داولي القديمة الأسبوع ال 12 مع الحقن في العضل من 2٪ زيلازين (5.6 ملغ / كلغ) وتلييتامين بالإضافة إلى zolazepam (18 ملغ / كلغ). قرصة بلطف على جلد الحيوانات لتأكيد التخدير المناسبة في غياب الوخز الجلد.
  2. غرس قطرة واحدة من 0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد للعين اليمنى من كل الفئران للحد من ألم في العين والتصرفات طرفة. غرسالتتراسيكلين مرهم للعين اليسرى لمنع جفاف القرنية.
  3. تبريد التحقيق الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر = 3 ملم) في النيتروجين السائل. تطبيق مسبار الفولاذ المقاوم للصدأ إلى القرنية المركزية في العين اليمنى لمدة 30 ثانية. كثيرا ما غرس في برنامج تلفزيوني للعين اليمنى خلال الإجراء لمنع جفاف القرنية.
  4. غرس 0.1٪ الأتروبين و 0.3٪ كبريتات الجنتاميسين على الفور بعد cryoinjury ومرة ​​واحدة يوميا لتخفيف الألم العين الناتجة عن تشنج الهدبية، ومنع العدوى.
    1. بعد العملية، والحفاظ على الفئران الحارة باستخدام مصباح الحرارة، ومراقبة شفائهم كل 15 دقيقة بعد التخدير حتى يستعيد التحكم في المحركات. بالإضافة إلى ذلك، تطبيق التتراسيكلين مرهم للعين اليمنى لمنع جفاف القرنية خلال فترة النقاهة.
  5. كرر cryoinjury القرنية لمدة 3 أيام متتالية.
  6. لتقديم marimastat أو bFGF في الغرفة الأمامية للعين الفئران، تخدير الفئران كما هو موضح سابقا. غرس قطرة واحدة0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد في العين اليمنى للتقليل من ألم في العين والتصرفات طرفة.
  7. لري سطح العين مع برنامج تلفزيوني العقيمة. أداء الأمامي بزل غرفة تحت المجهر التشغيل عن طريق إدخال إبرة 30 G تعلق على حقنة 1 مل في القرنية واضحة paralimbal في طائرة أعلاه وبالتوازي مع القزحية.
  8. تحويل إبرة شطبة يصل، وخفض قليلا الجرح القرنية لاستنزاف بعض الخلط المائي وتقليل الضغط داخل العين. حقن 0.02 مل من المخدرات intracamerally. ضغط بلطف الجهاز إبرة مع طرف القطن خلال سحب الإبرة.
  9. تصوير العين الخارجية في مرحلة الزمنية المشار إليها تحت المجهر التشغيل.

3. حصاد الجرذ زر القرنية والمناعية

  1. إلى الموت ببطء الفئران، ووضعها في غرفة القتل الرحيم ويبث 100٪ CO 2 بمعدل ملء من 10-30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة الواحدة. الحفاظ CO 2 ضخ لدقيقة إضافية بعد عدم وجود التنفس وتلاشى لون العين.
  2. اختراق العين الفئران في حوف بشفرة حادة. قطع القرنية مع مقص القرنية على طول حوف. تسطيح القرنية على شريحة. جعل شقوق شعاعي إضافية إذا القرنيات عقص.
  3. إصلاح القرنيات مع 250 ميكرولتر من 4٪ لامتصاص العرق، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize مع 250 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق، ومنع مع 10٪ البقري ألبومين المصل لمدة 30 دقيقة.
  4. احتضان القرنيات مع الأجسام المضادة الأولية ضد ABC بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع التخفيف من 1: 200 في مخفف الأجسام المضادة. غسل القرنيات مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة، واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية (1: 100 في مخفف الضد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. مباين نواة الخلية التي تغطي الخلايا مع 2 ميكروغرام / مل من 4، 6 diamidino-2-phenylindole، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
  5. جبل القرنيات في مكافحة يتلاشى حل المتصاعدة. أوبتين الصور مناعي في موجات الإثارة من 405 و 561 نانومتر مع المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر في 20X التكبير موضوعي.

النتائج

بعد عزل CECS الأبقار، كانت الخلايا المستزرعة في المختبر الشكل 1 يعرض الصور الطوري من CECS البقري. وأشار شكل سداسي الخلايا في التقاء أن الخلايا لم تكن ملوثة الليفية انسجة القرنية خلال العزلة خلية الشكل 2 يصور المناعية التي تم تنفيذ...

Discussion

ومن المعروف CECS لميلها للخضوع EnMT خلال تكاثر الخلايا. لوضع استراتيجيات لقمع عملية EnMT لأغراض علاجية، فهم دقيق لآلية EnMT ضروري. وصفنا 2 نماذج للتحقيق EnMT، وهي لجنة الانتخابات المركزية البقري في نموذج الثقافة المختبر والفئران بطانة القرنية نموذج cryoinjury. أظهرت نتائ...

Disclosures

The authors have no competing financial interests to declare.

Acknowledgements

We thank the staff of the Second Core Lab, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital for their technical support.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
trypsinThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 mediumThermoFisher Scientific11330
fetal bovine serumThermoFisher Scientific26140-079
dimethyl sulfoxideSigmaD2650
human epidermal growth factorThermoFisher ScientificPHG0311
insulin, transferrin, selenium ThermoFisher Scientific41400-045
cholera toxinSigmaC8052-1MG
gentamicinThermoFisher Scientific15750-060
amphotericin BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences111219
Triton X-100SigmaT8787 
bovine serum albuminSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anti-active beta-catenin antibodyMillpore05-665
anti-snail antibodySanta cruzsc28199
anti-slug antibodySanta cruzsc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermoFisher ScientificA-11001for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermoFisher ScientificA-11003for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyThermoFisher ScientificA-11008for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluentGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisher ScientificD1306
mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
laser scanning confocal microscopeZEISSLSM510
xylazine BayerN/A
tiletamine plus zolazepamVirbacN/Aveterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solutionAlconN/Aveterinary drug
0.1% atropineWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Aclinical drug 
0.3% gentamicin sulfateSinphar GroupN/Aclinical drug 
basic fibroblast growth factorThermoFisher ScientificPHG0024clinical drug 

References

  1. Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
  2. Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
  3. Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, 77-83 (2013).
  4. Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
  5. Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
  6. Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
  7. Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
  8. Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
  9. Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
  10. Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
  11. Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
  12. Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
  13. Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
  14. Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  15. Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
  16. Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
  17. Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
  18. Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
  19. Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
  20. Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
  21. Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
  22. Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
  23. Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114 N intracameral

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved