En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

Resumen

Un cultivo primario de células endoteliales corneales bovinas se utilizó para investigar el mecanismo de la transición endotelial-mesenquimal corneal. Además, se utilizó un modelo de endotelio corneal criolesión rata para demostrar transición endotelial-mesenquimal corneal in vivo.

Resumen

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Introducción

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protocolo

Todos los procedimientos seguidos en este estudio estaba de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán.

1. Aislamiento, cultivo primario de preparación, y la inmunotinción de bovino CEC

1. Adquirir nuevos ojos bovinos de un matadero local.
2. Desinfectar los ojos en una solución de povidona yodada al 10% w / v durante 3 min. Lavarlas con la solución salina (PBS) tamponada con fosfato.
3. Se recoge el botón corneal con un escalpelo y tijeras en condiciones estériles. membrana de la cáscara de la de Descemet con pinzas bajo un microscopio de disección (tenga en cuenta que en este estudio, los ojos bovinos fueron enucleados por un matadero local, por lo tanto, el primer procedimiento del estudio fue la desinfección de los ojos preenucleated en el laboratorio).
4. Incubar la membrana de Descemet en 1 ml de trypsin a 37 ° C durante 30 min. Recoge los países de Europa central bovina por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Resuspender las células en 1 ml de medio suplementado epitelial hormonal (SHEM) que contiene volúmenes iguales de HEPES-tamponada medio de Dulbecco modificado de Eagle y medio F12 de Ham, suplementado con suero bovino fetal al 5%, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de la epidermis humana factor de crecimiento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenio, 1 nmol / l de la toxina del cólera, 50 mg / ml de gentamicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B.
5. Sembrar las células (aproximadamente 1 x 10 ⁵ células por ojo) en una placa de 6 cm. Cultura en el Shem. Incubar la placa a 37 ° C en una atmósfera de 5% de _CO2 en aire. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
6. Cuando las células alcanzan la confluencia, lavarlos con PBS y se incuban en 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recójalas por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de la SHEM.
   1. Contar las células en un hemocitómetro. Sembrar las células en los portaobjetos de cubierta en una densidad de 1 x 10 ⁴ por pocillo en una placa de 24 pocillos, y cultivar las células en la SHEM. Para investigar el efecto de supresión de EnMT marimastat, se incuban las células en SHEM con 10 M de marimastat añadieron al medio de cultivo, y cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
7. Fijar las células en un punto de tiempo indicado con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 para 5 min. Bloque con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
8. Se incuban las células con anticuerpos primarios contra activa beta-catenina (ABC), caracoles, babosas y una noche a 4 ° C. La dilución de los anticuerpos primarios utilizados es 1: 200. Los anticuerpos se diluyeron en diluyente de anticuerpo compuesto por PBS 10 mM, 1% w / v albúmina de suero bovino, y 0,09% w / v de azida de sodio.
9. Lavar las células dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba lam con el anticuerpo conjugado con Alexa Fluor-secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr.
10. Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, se lavan las células dos veces con PBS durante 15 min, y montarlos con solución de montaje anti-decoloración.
11. Obtener imágenes de inmunofluorescencia en las longitudes de onda de excitación de 405 y 488 nm mediante el uso de un microscopio confocal de barrido láser con 20X aumento del objetivo.

2. Modelo de rata de la córnea del endotelio lesión criogénica y intracameral Inyección

1. Anestesie 12 semanas de edad ratas Sprague-Dawley macho con inyecciones intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) y tiletamina más zolazepam (18 mg / kg). pellizcar suavemente la piel de los animales para confirmar la anestesia adecuada en ausencia de contracciones de la piel.
2. Inculcar una gota de clorhidrato de proparacaína 0,5% en el ojo derecho de cada rata para minimizar el dolor ojo y el reflejo de parpadeo. Instilartetraciclina pomada para el ojo izquierdo para evitar la sequedad de la córnea.
3. Se enfría una sonda de acero inoxidable (diámetro = 3 mm) en nitrógeno líquido. Aplicar la sonda de acero inoxidable a la córnea central del ojo derecho durante 30 segundos. inculcar frecuentes PBS para el ojo derecho durante el procedimiento para evitar la sequedad de la córnea.
4. Inculcar 0,1% atropina y 0,3% de sulfato de gentamicina inmediatamente después de criolesión y una vez al día para aliviar el dolor ocular resultante de espasmo ciliar y para prevenir la infección.
   1. Después del procedimiento, mantienen las ratas caliente usando una lámpara de calor, y observar su recuperación cada 15 minutos después de la anestesia hasta recuperar el control del motor. Además, aplique una pomada de tetraciclina en el ojo derecho para evitar la sequedad de la córnea durante el período de recuperación.
5. Repetir la lesión criogénica de la córnea durante 3 días consecutivos.
6. Para la entrega de marimastat o bFGF en la cámara anterior de los ojos de rata, anestesiar las ratas como se describió anteriormente. Inculcar una gotade clorhidrato de proparacaına 0,5% en el ojo derecho para minimizar el dolor de los ojos y el reflejo de parpadeo.
7. El riego de la superficie ocular con PBS estéril. Realizar paracentesis de la cámara anterior con un microscopio de operación mediante la inserción de una aguja 30 G unida a una jeringa de 1 ml en la córnea clara paralimbales en un plano por encima y paralelo al iris.
8. Girar la aguja de bisel hacia arriba y presione ligeramente la herida corneal para drenar un poco de humor acuoso y reducir la presión intraocular. Inyectar 0,02 ml de la droga intracameral. comprimir suavemente el trayecto de la aguja con una punta de algodón durante la retirada de la aguja.
9. Fotografiar la parte externa del ojo en un punto de tiempo indicado bajo el microscopio quirúrgico.

3. Explotación del Rat botón corneal y Inmunoticción

1. Para practicar la eutanasia a las ratas, los coloca en una cámara de la eutanasia y de infundir 100% de CO ₂ a una velocidad de llenado del 10-30% del volumen de la cámara por minuto. Mantener CO ₂ de infusión para unaminuto adicional después de falta de respiración y color de los ojos se desvaneció.
2. Penetrar en el ojo de la rata en el limbo con una cuchilla afilada. Cortar las córneas con tijeras corneales a lo largo del limbo. Aplanar las córneas en una diapositiva. Hacer incisiones radiales adicionales si las córneas se encogen.
3. Fijar las córneas con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, y se bloquea con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
4. Incubar las córneas con anticuerpos primarios contra ABC durante la noche a 4 ° C con una dilución de 1: 200 en diluyente de anticuerpo. Lavar las córneas dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba con el anticuerpo secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr. Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, y lavar las células dos veces con PBS durante 15 min.
5. Montar las córneas en la solución de montaje protectora de la fluorescencia. Transmisión exteriorner las imágenes de inmunofluorescencia en longitudes de onda de excitación de 405 nm y 561 con un microscopio confocal de barrido láser de 20 aumentos objetivo.

Resultados

Después del aislamiento de CECs de la especie bovina, las células se cultivaron in vitro. La Figura 1 presenta las imágenes de contraste de fase de los países de Europa central de la especie bovina. La forma hexagonal de las células en confluencia indica que las células no estaban contaminadas por los fibroblastos del estroma corneal durante el aislamiento celular. Figura 2 representa la inmunotinción que se realizó utilizando anticuerpo...

Discusión

CECs son conocidos por su propensión a sufrir EnMT durante la proliferación celular. Para desarrollar estrategias para suprimir el proceso EnMT con fines terapéuticos, es necesario un conocimiento profundo del mecanismo EnMT. Describimos 2 modelos para investigar EnMT, a saber, la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro y la rata modelo de lesión criogénica endotelio corneal. Nuestros resultados demuestran el proceso EnMT en ambos modelos. Además, el efecto de supresión de EnMT de m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug