במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Summary

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

Abstract

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Introduction

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protocol

כל הנהלים המיושמים במחקר זה עולה בקנה אחד עם האגודה לחקר משפט חזון עיניים עבור שימוש בבעלי חי עיניים וחזון המחקר אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים האוניברסיטאי הלאומיים בטייוואן.

1. ניתוק, הכנת התרבות ראשית ולאחר Immunostaining של השור CECs

1. רוכשת עיני שור טריות מטבחיים מקומי.
2. לחטא את העיניים בתוך 10% w / v פתרון povidone יוד במשך 3 דקות. לשטוף אותם עם תמיסת מלח פוספט שנאגר (PBS).
3. קציר את הכפתור הקרני עם אזמל ומספריים בתנאים סטריליים. מקלף את הממברנה של Descemet עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח (לציין כי במחקר זה, בעיני השור היו enucleated ידי מטבחיים מקומי, ולכן הליך המחקר הראשון היה חיטוי בעיני preenucleated במעבדה).
4. דגירה הממברנה של Descemet ב 1 מ"ל של לנסותpsin על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אסוף את CECs שור על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום אפיתל הורמונלי השלים (שם) המכיל כמויות שווות של מדיום הנשר HEPES שנאגר השונה של Dulbecco והבינוני F12 של חם, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, sulfoxide דימתיל 0.5%, 2 ng / ml של אפידרמיס אדם גורם הגדילה, 5 מ"ג / מ"ל ​​של אינסולין, 5 מ"ג / מ"ל ​​של transferrin, 5 ng / ml של סלניום, 1 nmol / L של רעלן הכולרה, 50 מ"ג / מ"ל ​​של גנטמיצין, ו -1.25 מ"ג / מ"ל ​​של B. amphotericin
5. זרעים תאים (כ 1 x 10 ⁵ תאים לכל עין) לתוך צלחת 6 ס"מ. תרבות אותם שם. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO ₂ באוויר. שינוי התרבות בינוני כל 3 ימים.
6. כאשר התאים מגיעים למפגש, לשטוף אותם PBS דגירה אותם ב 1 מ"ל של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של שם טוב.
   1. ספירת התאים ב hemocytometer. זרעים התאים בשקופיות כיסוי בצפיפות של 1 x 10 ⁴ לכל היטב צלחת 24 גם, והתרבות התאים שם טוב. על חקירת השפעת EnMT-הדיכוי של marimastat, דגירת התאים שם טוב עם 10 מיקרומטר של marimastat הוסיפו לתוך מדיום התרבות, ולשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים.
7. תקן את התאים בנקודת זמן מצוינת עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות. חסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.
8. דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד-קטנין ביתא הפעיל (ABC), חילזון, חילזון הלילה ב 4 ° C.. הדילול של הנוגדנים העיקריים בשימוש הוא 1: 200. הנוגדנים הם מדולל diluent נוגדן מורכב של 10 מ"מ PBS, 1% w / v אלבומין בסרום שור, ו 0.09% w / v אזיד הנתרן.
9. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירהמ 'עם נוגדנים משני מצומדות פלואוריד אלקסה (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
10. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי התאים עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות, ו הר איתם נגד דהיית פתרון גובר.
11. להשיג תמונות immunofluorescent על אורכי גל עירור של 405 ו 488 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם 20X ההגדלה אובייקטיבי.

2. מודל עכברוש קרנית האנדותל Cryoinjury הזרקת Intracameral

1. להרדים 12 שבועות בן חולדות Sprague-Dawley זכר עם זריקה תוך שרירית של 2% xylazine (5.6 מ"ג / ק"ג) ו tiletamine בתוספת zolazepam (18 מ"ג / ק"ג). בעדינות לצבוט את העור של החיות כדי לאשר הרדמה תקינה בהעדר מתעוות עור.
2. להחדיר טיפה אחת של hydrochloride proparacaine 0.5% אל עינו הימנית של כל העכברים כדי למזער את הכאב העין ואת רפלקס מצמוץ. לְהַחדִירמשחת טטרציקלין לעין השמאל כדי למנוע יובש קרני.
3. מגניב בדיקת נירוסטה (קוטר = 3 מ"מ) בחנקן נוזלי. החלת את חללית הנירוסטה אל הקרנית המרכזית של עין ימין למשך 30 שניות. לעתים קרובות להנחיל PBS על עינו הימנית במהלך ההליך כדי למנוע יובש קרני.
4. להחדיר 0.1% אטרופין סולפט גנטמיצין 0.3% מייד לאחר cryoinjury ופעם יומי כדי להקל על כאב עיני נובע התכווצות ריסים ולמנוע זיהום.
   1. לאחר ההליך, לשמור על החולדות לחמם באמצעות מנורת חום, ולבחון החלים כל 15 דקות אחרי ההרדמה עד שהם להחזיר שליטה מוטורית. בנוסף, החל משח טטרציקלין לעין הזכות למנוע יובש קרני במהלך תקופת ההחלמה.
5. חזור על cryoinjury הקרנית במשך 3 ימים רצופים.
6. עבור אספקת marimastat או bFGF לתוך החדר הקדמי של עיני החולדה, להרדים החולדות כפי שתואר לעיל. להחדיר טיפה אחתשל hydrochloride proparacaine 0.5% אל תוך עינו הימנית כדי למזער את כאב עין ואת רפלקס המצמוץ.
7. להשקות את פני השטח של העין עם PBS סטרילית. בצע ניקור הלשכה הקדמית תחת מיקרוסקופ ההפעלה על ידי החדרת מחט 30 G מצורף מזרק 1 מ"ל על הקרנית ברור paralimbal במטוס מעל ובמקביל הקשתית.
8. סובבו את המחט שפוע למעלה, ומעט לדכא את הפצע בקרנית לנקז קצת הומור מימית ולהפחית את הלחץ התוך עיני. להזריק 0.02 מ"ל של התרופה intracamerally. בעדינות לדחוס את דרכי מחט עם קצה כותנה בזמן נסיגת המחט.
9. צלם את שלהוציא בנקודת זמן מצוינת מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.

3. קצירי העכברוש קרני לחצן ו Immunostaining

1. כדי להרדים את החולדות, למקם אותם בתא המתת חסד להשרות 100% CO ₂ בקצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה. שמור עירוי CO ₂ עבורדקה נוספת אחרי חוסר נשימת צבע עיניים דהוי.
2. לחדור לעין עכברוש בבית לימבוס עם להב חד. חותך את הקרניות במספריים קרניים לאורך לימבוס. שטח את הקרניות בשקופית. ודא חתכים רדיאליים נוספים אם הקרניות להתכרבל.
3. תקן את קרניות עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות, ולחסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.
4. דגירה קרנית עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC הלילה ב 4 ° C עם דילול של 1: 200 ב diluent נוגדן. שטפו את קרניות פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירה אותם עם נוגדנים משני (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי תאים עם 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות.
5. הר הקרני בתמיסה נגד דהייה גוברת. אובטיין התמונות immunofluorescent באורכי גל עירור של 405 ו 561 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר ב 20X ההגדלה אובייקטיבי.

תוצאות

לאחר בידוד של CECs שור, התאים היו בתרבית במבחנה. איור 1 מציג את התמונות בניגוד שלב של CECs שור. צורת המשושה של התאים בנקודת המפגש ציינה כי התאים לא היו מזוהמים על ידי פיברובלסטים סטרומה הקרניים במהלך בידוד תא. איור 2 מתארים את immunostaini...

Discussion

CECs ידוע נטייתן לעבור EnMT במהלך התפשטות תאים. כדי לפתח אסטרטגיות דיכוי תהליך EnMT למטרות טיפוליות, הבנה מעמיקה של מנגנון EnMT הכרחית. תיארנו 2 דגמים לחקור EnMT, כלומר CEC שור במודל תרבות במבחנה דגם cryoinjury האנדותל עכברוש הקרנית. התוצאות שלנו הוכיחו את תהליך EnMT בשני המוד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug