В пробирке и в естественных моделей для изучения роговичный эндотелий мезенхимальных перехода

Резюме

Первичная культура бычьих роговичных эндотелиальных клеток использовали для исследования механизма роговицы эндотелиальной-мезенхимальных перехода. Кроме того, эндотелий роговицы модель криоповреждений крыс использовали для демонстрации роговицы переход эндотелиальной-мезенхимальных в естественных условиях.

Аннотация

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Введение

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

протокол

Все процедуры, применяемые в данном исследовании был предоставлен с Ассоциацией по исследованиям в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и Vision Research и были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Национальной больницы Тайваньского университета путем.

1. Выделение, первичная культура Подготовка и Иммунологическое бычьего центральноевропейских стран

1. Приобретайте свежие бычьи глаза от местной скотобойни.
2. Лечить глаза в 10% вес / об повидон-йода в течение 3 мин. Промыть их раствором с фосфатным буфером (PBS).
3. Заготавливают кнопку роговичный скальпелем и ножницами в стерильных условиях. Мембрана Пил Десцеметова с пинцетом под микроскопом рассекает (обратите внимание, что в данном исследовании, бычьего глаза были энуклеировали местной скотобойни, поэтому первая процедура исследования была дезинфекция preenucleated глаз в лаборатории).
4. Инкубируйте мембраны Десцеметова в 1 мл попыткиpsin при 37 ° С в течение 30 мин. Собрать бычьей CECS центрифугированием при 112 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл дополненной гормонального эпителиальной среды (SHEM), содержащий равные объемы HEPES-забуференной модифицированной среде Дульбекко орла и среды F12 Хэма, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 0,5% диметилсульфоксида, 2 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста, 5 мг / мл инсулина, 5 мг / мл трансферрина, 5 нг / мл селена, 1 нмоль / л холерного токсина, 50 мг / мл гентамицина, и 1,25 мг / мл амфотерицина B.
5. Семенной клетки (приблизительно 1 × 10 ⁵ клеток на глаз) в 6 см чашку. Культура их в Шем. Инкубируйте блюдо при 37 ° С в атмосфере 5% CO ₂ в воздухе. Изменение культуральной среды каждые 3 дня.
6. Когда клетки достигают слияния, промыть их в PBS и инкубируют их в 1 мл трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Собирают их центрифугированием при 112 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл Шем.
   1. Граф клеток в гемоцитометра. Семенной клетки на крышке скользит при плотности 1 × 10 ⁴ на лунку в 24-луночного планшета и культуры клеток в Шем. Для исследования EnMT подавляющий эффект маримастату, инкубировать клетки в SHEM с 10 мкМ маримастату добавлены в культуральную среду, и изменение культуральной среды через каждые 3 дня.
7. Зафиксировать клетки, на указанный момент времени 250 мкл 4% параформальдегида, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. Проницаемыми с 250 мкл 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин. Блок с 10% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
8. Инкубируйте клетки с первичными антителами против активного бета-катенина (ABC), улитка, и слизня в течение ночи при температуре 4 ° С. Разбавление первичных антител составляет 1: 200. Антитела разводят в разбавителе антитела, состоящего из 10 мМ PBS, 1% вес / об бычий сывороточный альбумин, и 0,09% вес / об азид натрия.
9. Вымойте клетки дважды с PBS в течение 15 мин и инкубироватьм с Alexa Fluor-конъюгированного вторичного антитела (1: 100 в разбавителе антител) при комнатной температуре в течение 1 часа.
10. Проводят контрастное ядро ​​клетки путем покрытия клеток с 2 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола, промыть клетки дважды с PBS в течение 15 мин, и смонтировать их с анти-выцветанию решение для монтажа.
11. Получить иммунофлуоресцентного изображения при возбуждении длинами волн 405 и 488 нм с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с 20X объективным увеличением.

2. Крыса эндотелий роговицы криоповреждений Модель и внутрикамерное Инъекции

1. Обезболить 12-недельных крыс-самцов Sprague-Dawley с внутримышечных инъекций 2% ксилазином (5,6 мг / кг) и tiletamine плюс zolazepam (18 мг / кг). Аккуратно ущипнуть кожу животных, чтобы подтвердить правильность анестезии при отсутствии подергивание кожи.
2. Закапывание одну каплю 0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз каждой крысы, чтобы свести к минимуму боль глаза и рефлекс моргания. внушатьмазь тетрациклина в левый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы.
3. Охлаждают зонд из нержавеющей стали (диаметр = 3 мм) в жидком азоте. Нанести стального зонда из нержавеющей к центральной роговицы правого глаза в течение 30 сек. Часто привить PBS в правый глаз во время процедуры, чтобы предотвратить сухость роговицы.
4. Закапывание 0,1% атропин и 0,3% сульфата гентамицина сразу после криоповреждений и один раз в день, чтобы уменьшить глазной боли в результате цилиарного спазма и предотвратить инфекцию.
   1. После процедуры, держать крыс подогреть с помощью тепла лампы, и наблюдать за их восстановление через каждые 15 мин после анестезии, пока они не восстановить контроль двигателя. Кроме того, применяют мазь тетрациклина в правый глаз, чтобы предотвратить сухость роговицы в течение периода восстановления.
5. Повторите роговой криоповреждений в течение 3 дней подряд.
6. Для доставки маримастату или bFGF в переднюю камеру глаза крыс, анестезию крыс, как описано выше. Привить одну каплю0,5% пропаракаина гидрохлорида в правый глаз, чтобы свести к минимуму боль в глазах и рефлекс моргания.
7. Промывать глазную поверхность стерильным PBS. Выполнение передней камеры парацентез под операционным микроскопом, вставляя иглу 30 G, прикрепленную к 1 мл шприца в paralimbal прозрачного роговицы в плоскости и располагалась параллельно радужки.
8. Поверните иглу скосом вверх, и слегка нажмите на рану роговицы, чтобы слить некоторый водный юмор и снизить внутриглазное давление. Вводят 0,02 мл препарата intracamerally. Аккуратно сжать иглы тракта с наконечником хлопка во время снятия иглы.
9. Сфотографируйте внешний глаз на указанный момент времени под операционным микроскопом.

3. Сбор Крыса Роговичная Баттон и Иммунологическое

1. Для эвтаназии крыс, поместите их в эвтаназии камере и влить 100% CO ₂ при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту. Поддерживать CO ₂ инфузии в течениедополнительная минута после отсутствия дыхания и выцветшие глаза.
2. Проникнуть глаз крысы у лимба с острым лезвием. Вырезать роговицу ножницами вдоль роговицы лимба. Свести роговицу на слайде. Сделайте дополнительные радиальные надрезы, если роговица свернуться.
3. Закрепить роговицу с 250 мкл 4% параформальдегида, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. Проницаемыми с 250 мкл 0,5% Тритона Х-100 в течение 5 мин, и блок с 10% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.
4. Выдержите в роговицу с первичными антителами против ABC в течение ночи при 4 ° С с разбавлением 1: 200 в разбавителе антител. Промыть роговицу дважды с PBS в течение 15 мин, и инкубировать их с вторичным антителом (1: 100 в разбавителе антител) при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводят контрастное ядро ​​клетки путем покрытия клеток с 2 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола, и промыть клетки дважды с PBS в течение 15 мин.
5. Установите роговицу в анти-выцветания решение для монтажа. ОбьТайн в иммунофлуоресцентного изображения при возбуждении длинами волн 405 и 561 нм с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при увеличении 20Х объективного.

Результаты

После выделения крупного рогатого скота центральноевропейских стран, клетки культивировали в пробирке. На рисунке 1 представлены фазовый контраст изображения говяжьих центральноевропейских стран. Шестиугольная форма клеток при слиянии показали , что ...

Обсуждение

CECs известны своей склонностью к претерпевать EnMT во время пролиферации клеток. Для того, чтобы разработать стратегии для подавления процесса EnMT в терапевтических целях, глубокое понимание механизма EnMT необходимо. Мы описали 2 модели для исследования EnMT, а именно ЦИК крупного рогатого с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug