In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Resumo

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

Resumo

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Introdução

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protocolo

Todos os procedimentos seguidos neste estudo concedidas com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do National Taiwan University Hospital.

1. Isolamento, cultura Preparação Primária e imunocoloração de Bovinos PEC

1. Adquirir olhos bovinos frescas de um matadouro local.
2. Desinfectar os olhos em um 10% w / v solução de povidona-iodo durante 3 min. Lavá-las com uma solução tamponada de fosfato salino (PBS).
3. Colheita do botão da córnea com um bisturi e tesouras sob condições estéreis. membrana de Descemet Descasque a com uma pinça sob um microscópio de dissecação (notar que, neste estudo, os olhos foram enucleados bovina por um matadouro local, portanto, o primeiro procedimento de pesquisa foi a desinfecção dos olhos preenucleated no laboratório).
4. Incubar a membrana de Descemet, em 1 ml de tentativapsin a 37 ° C durante 30 min. Recolher os CECs bovinos por centrifugação a 112 xg por 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de meio suplementado epitelial hormonal (SHEM) contendo volumes iguais de meio de HEPES-tamponizada de Dulbecco modificado por Eagle e meio F12 de Ham, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de epidérmico humano factor de crescimento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selénio, 1 nmol / l de toxina de cólera, 50 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg / ml de anfotericina B.
5. Semear as células (cerca de 1 x 10 ⁵ células por olho) em um disco de 6 cm. Cultura-los no Sem. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% _{de CO2} em ar. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias.
6. Quando as células atingem a confluência, lavá-las em PBS e incubar em 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recolhe-los por centrifugação a 112 xg durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de SHEM.
   1. Contar as células num hemocitómetro. Semear as células sobre lâminas de cobertura a uma densidade de 1 x 10 ⁴ por poço numa placa de 24 poços, e as células de cultura na SHEM. Para investigar o efeito de suprimir EnMT-marimastat, incubar as células em SHEM com 10 uM de marimastat adicionado para o meio de cultura, e mudar o meio de cultura a cada 3 dias.
7. Fixar as células em um ponto de tempo indicado com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min. Bloco com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
8. Incubam-se as células com anticorpos primários contra activo beta-catenina (ABC), caracol, e lesma durante a noite a 4 ° C. A diluição dos anticorpos primários utilizados é de 1: 200. Os anticorpos são diluídos em diluente de anticorpo composta de PBS 10 mM, 1% w / v de albumina de soro de bovino, e 0,09% w / v de azida de sódio.
9. Lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e incuba-se am, com o anticorpo conjugado com Alexa Fluor-secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h.
10. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e montá-los com anti-desvanecimento solução de montagem.
11. Obter imagens de imunofluorescência nos comprimentos de onda de excitação de 405 e 488 nm usando um microscópio confocal de varredura a laser, com ampliação de 20x objetiva.

2. Rat Corneal endotélio criolesão modelo e injeção intracamerais

1. Anestesiar ratos machos 12 semanas de idade, Sprague-Dawley machos com injecções intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) e mais tiletamina zolazepam (18 mg / kg). Suavemente comprimir a pele dos animais para confirmar a anestesia adequada na ausência de espasmos pele.
2. Instilar uma gota de cloridrato de proparacaína 0,5% no olho direito de cada rato para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar. instilarpomada de tetraciclina para o olho esquerdo para evitar o ressecamento da córnea.
3. Arrefece-se uma sonda de aço inoxidável (diâmetro = 3 mm) em azoto líquido. Aplicar a sonda de aço inoxidável para o centro da córnea do olho direito durante 30 seg. incutir frequentes PBS para o olho direito durante o procedimento para prevenir o ressecamento da córnea.
4. Instilar 0,1% atropina e 0,3% de sulfato de gentamicina imediatamente após criolesão e uma vez ao dia para aliviar a dor ocular resultante de espasmo ciliar e para prevenir a infecção.
   1. Após o procedimento, manter os ratos aquecer usando uma lâmpada de calor, e observar a sua recuperação a cada 15 minutos após a anestesia até que recuperar o controle motor. Além disso, aplique pomada de tetraciclina para o olho direito de prevenir o ressecamento da córnea durante o período de recuperação.
5. Repita o criolesão córnea durante 3 dias consecutivos.
6. Para entregar o marimastat ou de bFGF na câmara anterior dos olhos de ratos, anestesiar os ratos, tal como descrito anteriormente. Instilar uma gotade 0,5% de cloridrato proparacaína no olho direito para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar.
7. Irrigar a superfície ocular com PBS estéril. Realizar paracentese da câmara anterior sob um microscópio de operação através da inserção de uma agulha de 30 G ligada a uma seringa de 1 ml na córnea clara paralimbal num plano acima e paralelo ao da íris.
8. Rode a agulha de bisel para cima, e ligeiramente deprimir o ferimento da córnea para drenar um pouco de humor aquoso e reduzir a pressão intra-ocular. Injectar 0,02 ml da droga intracamerally. Gentilmente comprimir o trato agulha com uma ponta de algodão durante a retirada da agulha.
9. Fotografar a parte externa do olho em um ponto de tempo indicado sob o microscópio cirúrgico.

3. Colheita do Rato Botão de córnea e imunocoloração

1. A eutanásia os ratos, coloque-os em uma câmara de eutanásia e infundir 100% de _CO2 a uma taxa de preenchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto. Manter CO ₂ para uma infusãominuto adicional após a falta de respiração e cor dos olhos desapareceu.
2. Penetrar no olho do rato no limbo com uma lâmina afiada. Corte as córneas com uma tesoura ao longo da córnea do limbo. Achate as córneas em um slide. Fazer incisões radiais adicionais se as córneas enrolar.
3. Fixar as córneas com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, e bloquear com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
4. Incubar as córneas com anticorpos primários contra ABC durante a noite a 4 ° C com uma diluição de 1: 200 em diluente de anticorpo. Lavam-se as córneas, duas vezes com PBS durante 15 min, e incubar com o anticorpo secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, e lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min.
5. Monte as córneas em anti-fading solução de montagem. obtain as imagens de imunofluorescência em comprimentos de onda de excitação de 405 e 561 nm com um microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 20x objetiva.

Resultados

Após o isolamento de PEC bovina, as células foram cultivadas in vitro. A Figura 1 apresenta as imagens de contraste de fase do PEC bovina. A forma hexagonal das células em confluência indicaram que as células não foram contaminadas pelos fibroblastos do estroma da córnea durante o isolamento de células. A Figura 2 mostra a imunocoloração que foi realizada utilizando anticorpos contra ABC, caracol, e lesma em um ponto de tempo indicado....

Discussão

PEC são conhecidos pela sua propensão para sofrer EnMT durante a proliferação celular. Para desenvolver estratégias para suprimir o processo EnMT para fins terapêuticos, uma profunda compreensão do mecanismo EnMT é necessário. Nós descrevemos 2 modelos para investigar EnMT, ou seja, a CEC bovina em modelo de cultura in vitro e rato modelo criolesão endotélio corneano. Os nossos resultados demonstram o processo EnMT em ambos os modelos. Além disso, o efeito de supressão de EnMT marimastat ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug