In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Zusammenfassung

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

Zusammenfassung

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Einleitung

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protokoll

Alle folgten die Verfahren in dieser Studie mit der Association for Research gewährt in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der National Taiwan University Hospital genehmigt.

1. Isolierung, Primärkultur Vorbereitung, und Immunfärbung von Bovine MEL

1. Erwerben Sie frische Rinderaugen von einem lokalen Schlachthof.
2. Desinfizieren der Augen in einer 10% w / v Povidon-Iod-Lösung für 3 min. Wasche sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung.
3. Ernten Sie die Hornhaut-Taste mit einem Skalpell und Schere unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie die Descemet-Membran mit einer Pinzette unter einem Binokular (beachten Sie, dass in dieser Studie wurden die Rinderaugen von einem örtlichen Schlachthof entkernte, daher ist die erste Studie Verfahren war die Desinfektion der preenucleated Augen im Labor).
4. Inkubieren der Membran Descemet in 1 ml tryPSIN bei 37 ° C für 30 min. Sammeln Sie die Rinder MEL durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml supplementiert hormonellen epithelial Medium (SHEM) gleiche Volumina von HEPES-gepufferter Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium und Ham-F12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 0,5% Dimethylsulfoxid, 2 ng / ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mg / ml Insulin, 5 mg / ml Transferrin, 5 ng / ml Selen, 1 nmol / l des Choleratoxins, 50 mg / ml Gentamicin und 1,25 mg / ml Amphotericin B.
5. Seed die Zellen (etwa 1 x 10 ⁵ Zellen pro Auge) in eine 6 cm Schale. Kultur sie in der SHEM. Inkubiere die Schale bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO ₂ in Luft. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
6. Wenn die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie sie in PBS und Inkubation sie in 1 ml Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml des SHEM.
   1. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer. Seed die Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 10 ⁴ pro Well in einer 24-Well - Platte und Kultur die Zellen in der SHEM. die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimastat zur Untersuchung, inkubiere die Zellen in SHEM mit 10 uM Marimastat in das Kulturmedium gegeben, und das Kulturmedium alle 3 Tage.
7. Fixieren Sie die Zellen in einem angegebenen Zeitpunkt mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 5 min. Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min.
8. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern gegen aktive Beta-Catenin (ABC), Schnecke und Schnecke über Nacht bei 4 ° C. Die Verdünnung der primären Antikörpern verwendet wird, ist 1: 200. Die Antikörper werden in Antikörperverdünnungslösung, bestehend aus 10 mM PBS, 1% w / v Rinderserumalbumin und 0,09% w / v Natriumazid verdünnt.
9. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 min und Inkubation derm mit dem Alexa Fluor-konjugiertem sekundärem Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std.
10. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 & mgr; g / ml 4 abdeckt ', 6-diamidino-2-phenylindole, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 Minuten, und montieren sie mit Anti-Fading-Montagelösung.
11. Erhalten Immunofluoreszenz Bilder bei den Anregungswellenlängen von 405 und 488 nm durch ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit 20X Objektivvergrößerung verwendet.

2. Rat Korneaendothelium cryoinjury Modell und intrakamerale Injection

1. Anästhesieren 12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten mit intramuskulären Injektionen von 2% Xylazin (5,6 mg / kg) und Tiletamin und Zolazepam (18 mg / kg). kneifen sanft die Haut der Tiere geeignete Anästhesie in Abwesenheit von Haut Zucken zu bestätigen.
2. Flößen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid dem rechten Auge jeder Ratte Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren. einflößenTetracyclin-Salbe auf das linke Auge kornealen Trockenheit zu verhindern.
3. Kühlen Sie eine Sonde aus rostfreiem Stahl (Durchmesser = 3 mm) in flüssigem Stickstoff. Tragen Sie die Sonde aus rostfreiem Stahl an die zentrale Hornhaut des rechten Auges für 30 Sekunden. Häufig PBS für das rechte Auge während des Verfahrens zu vermitteln kornealen Trockenheit zu verhindern.
4. Instill 0,1% Atropin und 0,3% Gentamicinsulfat unmittelbar nach cryoinjury und einmal täglich Augenschmerzen zu lindern von Ziliarspasmus ergeb und Infektion zu verhindern.
   1. Nach dem Eingriff halten die Ratten mit einer Heizlampe erwärmen und ihre Genesung alle 15 Minuten nach der Narkose zu beobachten, bis sie Motor wieder die Kontrolle. Zusätzlich Tetracyclin-Salbe auf das rechte Auge gelten für Hornhauttrockenheit während der Erholungsphase zu verhindern.
5. Wiederholen Sie die Hornhaut cryoinjury für 3 aufeinander folgenden Tagen.
6. Für die Bereitstellung von Marimastat oder bFGF in die vordere Kammer des Rattenaugen, anästhesieren die Ratten, wie vorher beschrieben. Flößen Sie einen Tropfenvon 0,5% Proparacainhydrochlorid in das rechte Auge Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren.
7. Spülen Sie die Augenoberfläche mit sterilem PBS. Führen Vorderkammer Parazentese unter einem Operationsmikroskop mit einer 30 G-Nadel in eine 1 ml Spritze am paralimbal klare Hornhaut in einer Ebene oberhalb und parallel zu der Iris befestigt Einsetzen.
8. Drehen Sie die Nadel Schräge nach oben, und drücken Sie leicht die Hornhautwunde etwas wässrigen Humor und reduzieren den intraokularen Druck abzulassen. Injizieren 0,02 ml des intrakameral Droge. Vorsichtig komprimieren während der Nadel Rückzug der Nadel-Darm-Trakt mit einem Wattestäbchen.
9. Fotografieren Sie das äußere Auge bei einer angegebenen Zeitpunkt unter dem Operationsmikroskop.

3. Ernten der Ratte Corneal Knopf und Immunostaining

1. Um die Ratten einschläfern, legen Sie sie in einer Euthanasie Kammer und ziehen lassen 100% CO ₂ bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. Pflegen CO ₂ Infusion für eineweitere Minute nach mangelnder Atmung und verblasste Augenfarbe.
2. Dringen die Ratte Auge am Limbus mit einer scharfen Klinge. Schneiden Sie die Hornhaut mit Hornhaut-Schere entlang des Limbus. Flatten die Cornea auf einer Folie. Nehmen Sie zusätzliche radiale Einschnitte, wenn die Cornea einrollen.
3. Fix die Cornea mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 für 5 min, und der Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min.
4. Inkubieren der Kornea mit primären Antikörpern gegen ABC über Nacht bei 4 ° C mit einer Verdünnung von 1: 200 in Antikörperverdünnungsmittel. Waschen Sie die Cornea zweimal mit PBS für 15 min, und inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 & mgr; g / ml 4 abdeckt ', 6-Diamidino-2-phenylindol und die Zellen zweimal waschen mit PBS für 15 min.
5. Montieren Sie die Cornea in der Anti-Fading-Montagelösung. ObTain die Immunfluoreszenz-Bilder bei Anregungswellenlängen von 405 und 561 nm mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop bei 20facher Objektivvergrößerung.

Ergebnisse

Nach der Isolierung von Rinder-MEL wurden die Zellen in vitro kultiviert. Abbildung 1 zeigt die Phasenkontrastbilder der Rinder-MEL. Die hexagonale Form der Zellen bei Konfluenz angedeutet , dass die Zellen durch Fibroblasten während der Zellisolierung Hornhaut Stroma nicht kontaminiert wurden. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung , die Antikörper gegen ABC, Schnecke und Schnecke mit in einem angegebenen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Abgesehen...

Diskussion

CECs sind für ihre Neigung bekannt ENMT während der Zellproliferation zu unterziehen. Entwicklung von Strategien zur Unterdrückung des ENMT Prozess zu therapeutischen Zwecken, ein gründliches Verständnis der ENMT Mechanismus notwendig. Wir 2 beschriebenen Modelle ENMT, nämlich die Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell und Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die ENMT Prozess in beiden Modellen. Darüber hinaus wurde die ENMT Unterdrückungseffekt von ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug