In vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la transition cornéenne endothéliale-mésenchymateuses

Résumé

Une culture primaire de cellules endothéliales de cornée bovine a été utilisée pour étudier le mécanisme de transition endotheliale de la cornée mésenchymateuses. En outre, un modèle d'endothélium cornéen cryolésion de rat a été utilisé pour démontrer la transition de l' endothélium de la cornée mésenchymateuses in vivo.

Résumé

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Introduction

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protocole

Toutes les procédures suivies dans cette étude accordée à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle du National Taiwan University Hospital.

1. Isolement, Culture Préparation primaire, et immunocoloration de Bovine CECs

1. Acquérir les yeux frais de bovins à partir d'un abattoir local.
2. Désinfecter les yeux d'une solution aqueuse à 10% p / v povidone-iode pendant 3 min. les laver avec une solution saline (PBS), une solution tamponnée au phosphate.
3. Récolter le bouton cornéen avec un scalpel et les ciseaux dans des conditions stériles. la membrane de Peel Descemet avec une pince sous un microscope à dissection (à noter que dans cette étude, les yeux bovins ont été énucléés par un abattoir local et, par conséquent, la première procédure d'étude était la désinfection des yeux preenucleated dans le laboratoire).
4. Incuber la membrane de Descemet dans 1 ml d'essayerPSIN à 37 ° C pendant 30 min. Ramassez les CECs bovine par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu supplémenté épithéliale hormonale (SHEM) contenant des volumes égaux de tampon HEPES milieu Eagle modifié par Dulbecco et du milieu F12 de Ham, supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin, 0,5% de diméthylsulfoxyde, 2 ng / ml de l'épiderme humain facteur de croissance, 5 mg / ml d'insuline, 5 mg / ml de transferrine, 5 ng / ml de sélénium, 1 nmole / l de la toxine du choléra, 50 mg / ml de gentamicine et 1,25 mg / ml d'amphotéricine B.
5. Ensemencer les cellules (environ 1 x 10 ⁵ cellules par oeil) dans un plat de 6 cm. Culture eux dans la SHEM. Incuber le plat à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO ₂ dans l' air. Changer le milieu de culture tous les 3 jours.
6. Lorsque les cellules atteignent la confluence, lavez-les dans du PBS et incuber dans 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. Collectionnez-les par centrifugation à 112 g pendant 5 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de la SHEM.
   1. Compter les cellules dans un hémocytomètre. Ensemencer les cellules sur des lames de couverture à une densité de 1 x 10 ⁴ par puits dans une plaque de 24 puits, et la culture des cellules de la SHEM. Pour étudier l'effet EnMT-suppression de marimastat, incuber les cellules dans SHEM avec 10 uM de marimastat ajouté dans le milieu de culture, et de changer le milieu de culture tous les 3 jours.
7. Fixer les cellules à un point de temps indiqué avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min. Poulie à 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min.
8. Incuber les cellules avec des anticorps primaires contre actifs bêta-caténine (ABC), escargot, et slug nuit à 4 ° C. La dilution des anticorps primaires utilisés est de 1: 200. Les anticorps sont dilués dans du diluant d'anticorps composée de 10 mM de PBS, 1% p / v de sérum-albumine bovine et 0,09% en poids / azoture de sodium c.
9. Laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et on incube lem avec l'anticorps conjugué Alexa Fluor secondaire (1: 100 dans le diluant d'anticorps) à la température ambiante pendant 1 h.
10. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min, et de les monter avec une solution anti-décoloration de montage.
11. Obtenir des images d'immunofluorescence aux longueurs d'onde d'excitation de 405 et 488 nm en utilisant un microscope confocal à balayage laser, avec un grossissement de 20x objectif.

2. Modèle de rat cornéenne endothéliale cryolésion et injection intracamérulaire

1. Anesthésier 12 semaines vieux rats mâles Sprague-Dawley par une injection intramusculaire de xylazine à 2% (5,6 mg / kg) et de la tilétamine, plus zolazepam (18 mg / kg). Pincez doucement la peau des animaux pour confirmer l'anesthésie appropriée en l'absence de contractions de la peau.
2. Instiller une goutte de 0,5% de chlorhydrate de proparacaine à l'oeil droit de chaque rat pour réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement. Insufflertétracycline pommade à l'œil gauche pour prévenir la sécheresse de la cornée.
3. Refroidir une sonde en acier inoxydable (diamètre = 3 mm) dans de l'azote liquide. Appliquer la sonde en acier inoxydable à la cornée centrale de l'oeil droit pendant 30 sec. Fréquemment instiller PBS à l'oeil droit lors de la procédure pour prévenir la sécheresse de la cornée.
4. Instiller 0,1% atropine et 0,3% de sulfate de gentamicine immédiatement après cryolésion et une fois par jour pour soulager la douleur oculaire résultant de ciliaire spasme et pour prévenir l'infection.
   1. Après la procédure, garder les rats chaud à l'aide d'une lampe de chaleur, et d'observer leur récupération toutes les 15 min après l'anesthésie jusqu'à ce qu'ils reprennent le contrôle du moteur. En outre, appliquer la pommade tétracycline à l'oeil droit pour prévenir la sécheresse de la cornée au cours de la période de récupération.
5. Répétez l'cryolésion cornéenne pendant 3 jours consécutifs.
6. Pour délivrer le marimastat ou bFGF dans la chambre antérieure de l'œil de rat, anesthésier les rats comme décrit précédemment. Instiller une gouttede 0,5% de chlorhydrate de proparacaine dans l'œil droit de réduire au minimum la douleur oculaire et le réflexe de clignement.
7. Irriguer la surface oculaire avec du PBS stérile. Effectuer la chambre antérieure paracentèse sous un microscope opératoire en insérant une aiguille 30 G attachée à une seringue de 1 ml à la cornée claire paralimbiques dans un plan au-dessus et parallèle à l'iris.
8. Tourner l'aiguille biseau vers le haut, et légèrement appuyer sur la plaie cornéenne pour drainer une certaine humeur aqueuse et réduire la pression intra-oculaire. Injecter 0,02 ml du médicament intracamérulaire. comprimer doucement le tube de l'aiguille avec une pointe de coton pendant le retrait de l'aiguille.
9. Photographie de l'œil externe à un point de temps indiqué sous le microscope opératoire.

3. La récolte du Rat Bouton cornéenne et immunocoloration

1. Pour euthanasier les rats, les placer dans une chambre de l' euthanasie et laisser infuser 100% de CO ₂ à un taux de 10-30% du volume de la chambre par minute de remplissage. Maintenir le CO ₂ pour une perfusionminute supplémentaire suite à l'absence de la respiration et la couleur des yeux fané.
2. Pénétrer l'œil de rat au limbe avec une lame tranchante. Couper les cornées avec des ciseaux cornéens le long du limbe. Aplatir les cornées sur une diapositive. Faire des incisions radiales supplémentaires si les cornées se recroquevillent.
3. Fixer les cornées avec 250 pi de paraformaldehyde à 4%, pH 7,4, pendant 30 min à température ambiante. Perméabiliser avec 250 ul de 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min, et de bloquer 10% de sérumalbumine bovine pendant 30 min.
4. Incuber les cornées avec des anticorps primaires contre ABC pendant une nuit à 4 ° C avec une dilution de 1: 200 dans le diluant d'anticorps. Laver les cornées fois avec du PBS pendant 15 min, et de les laisser incuber avec l'anticorps secondaire (1: 100 dans le diluant d'anticorps) à la température ambiante pendant 1 h. Contre-coloration dans le noyau cellulaire, en recouvrant les cellules avec 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, et laver les cellules deux fois avec du PBS pendant 15 min.
5. Monter les cornées en anti-fading solution de montage. Obnir les images d'immunofluorescence aux longueurs d'onde d'excitation de 405 et 561 nm avec un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 20x objectif.

Résultats

Après l'isolement du PEC bovine, les cellules ont été cultivées in vitro. La figure 1 présente les images de contraste de phase de la CEC bovine. La forme hexagonale des cellules à confluence indiqué que les cellules ne sont pas contaminés par la cornée fibroblaste stromale lors de l' isolement cellulaire. La figure 2 représente la immunocoloration qui a été effectuée en utilisant des anticorps contre ABC, escargot, et slug ...

Discussion

CECs sont connus pour leur propension à subir des EnMT pendant la prolifération cellulaire. Pour élaborer des stratégies pour supprimer le processus EnMT à des fins thérapeutiques, une compréhension approfondie du mécanisme EnMT est nécessaire. Nous avons décrit 2 modèles pour étudier EnMT, à savoir la CCE bovine dans le modèle de culture in vitro et le rat endothélium cornéen modèle cryolésion. Nos résultats ont démontré le processus EnMT dans les deux modèles. En outre, l'ef...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug