Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Özet

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Özet

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

Giriş

Corneal endothelial cells (CECs) play a vital role in maintaining corneal clarity and thus visual acuity by regulating the hydration status of the corneal stroma through active pumping¹. Because of the limited proliferative potential of human CECs, the cell number decreases with age, and the repair of corneal endothelial wounds following injury is usually achieved through cell enlargement and migration, rather than cell mitosis². When the CEC count decreases below a threshold of approximately 500 cells/mm², the dehydration status of the corneal stroma cannot be maintained, leading to bullous keratopathy and vision impairment^3,4.

The limited proliferative potential of human CECs has been attributed to several factors, including reduced expression of the epidermal growth factor and its receptor in aging cells⁵, antiproliferative TGFβ2 in the aqueous humor⁶, and contact inhibition^2,7. Although some growth factors, such as basic fibroblast growth factor (bFGF), can increase proliferation in a cultured human corneal endothelium, the culture efficiency remains limited^8,9. Furthermore, CECs may undergo a phenotypic change during ex vivo expansion, resembling epithelial-mesenchymal transition (EMT)^10-13. Endothelial-mesenchymal transition (EnMT) is characterized by cell junction destabilization, apical-basal polarity loss, cytoskeletal rearrangement, alpha smooth muscle actin expression, and type I collagen secretion¹⁴. All of these characteristics may abrogate the normal function of CECs, hampering the use of ex vivo cultured CECs in tissue engineering. Moreover, EnMT has been associated with the pathogenesis of several corneal endothelial diseases, including Fuchs endothelial corneal dystrophy and retrocorneal membrane formation^15,16. Therefore, understanding the mechanism of EnMT may aid in manipulating the EnMT process and facilitate the regeneration of CECs to enable competent function.

In this study, we described a method for isolating bovine CECs from the corneal button. In the primary culture in vitro, the EnMT process, including a phenotypic change, the nuclear translocation of β-catenin, and EMT regulators snail and slug, was observed. We further described a method for demonstrating EnMT in vivo by using a rat corneal endothelium cryoinjury model. Using these 2 models, we demonstrated that marimastat, a broad-spectrum matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor, can suppress the EnMT process. The described protocols facilitate the detailed analysis of the EnMT mechanism and the development of strategies for manipulating the EnMT process for further clinical application.

Protokol

Tüm işlemler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği ile tanınan bu çalışmada izlenen ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. İzolasyon, İlköğretim Kültür Hazırlama ve Bovine CDKÖ immün

1. Yerel bir mezbahaya taze sığır gözleri kazanır.
2. 3 dakika boyunca% 10 w / v povidon-iyot çözeltisi gözleri dezenfekte. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile yıkanır.
3. steril koşullar altında bir neşter ve makas ile kornea düğmeye hasat. bir mikroskop altında forseps ile Peel Descemet membranı (bu çalışmada unutmayın, sığır gözler yerel bir mezbahaya tarafından iki parçaya ayrıldı, bu nedenle ilk çalışma prosedürü laboratuvarda preenucleated gözlerinin dezenfeksiyon idi).
4. try 1 ml Descemet membran inkübe30 dakika boyunca 37 ° C'de psin. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile sığır CDKÖ toplayın. takviye hormon epitel ortam (SHEM) HEPES-tamponlu Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ve% 5 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Ham F12 ortamında,% 0.5 dimetil sülfoksit, insan epidermal 2 ng / ml arasında eşit hacimlerde ihtiva eden 1 ml hücrelerin tekrar büyüme faktörü, 5 mg / ml arasında insülin, 5 mg / transferin ml, 5 ng / selenyum mi, kolera toksin 1 nmol / L, 50 mg / ml gentamisin ve 1.25 mg / amfoterisin B mi
5. 6 cm çanak içine hücreleri (gözün başına yaklaşık 1 x 10 ⁵ hücre) Tohum. Sam'ın Kültür onları. Hava içinde% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C 'de çanak inkübe edin. 3 günde kültür ortamı değiştirin.
6. Hücreler kaynaşmaya eriştikten sonra, PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin 1 ml inkübe. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile toplayın. Sam'ın 1 ml hücre pelletini yeniden askıya.
   1. Bir hemasitometre hücreleri saymak. Bir 24-yuvalı plaka içinde çukur başına 1 x 10 ⁴ yoğunluğuna ve kültür Sam hücreleri de kapaklı lam üzerinde hücreleri tohumu. marimastat arasında EnMT bastırıcı etkilerini araştırmak için, marimastat uM kültür ortamına ilave 10 Sam hücreleri inkübe ve her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin.
7. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile belirtilen bir zaman noktasında hücreleri saptamak. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği. 30 dakika boyunca% 10 inek serumu albümini ile bloklayın.
8. gece boyunca 4 ° C 'de, aktif beta-katenin (ABC), salyangoz ve sevk borusu karşı birincil antikor ile inkübe hücreleri. 200: kullanılan birincil antikor seyreltme 1'dir. antikorlar, 10 mM PBS,% 1 w / v sığır serum albümini ve% 0.09 w / v sodyum asid oluşan antikor seyreltici içinde seyreltilir.
9. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve inkübe1 saat süre ile oda sıcaklığında (antikor seyreltici içinde 1: 100) ve Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor ile m.
10. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol 2 ug / ml hücreleri kapsayan, hücre çekirdeğine Counterstain, 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve montaj çözümü, anti-solma ile monte edilir.
11. 20X objektif büyütme ile bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak 405 ve 488 nm uyarma dalga boylarında immunofluorescent görüntüleri elde edebilir.

2. Sıçan Kornea Endotel Cryoinjury Modeli ve İntrakameral Enjeksiyon

1. % 2 ksilazin (5.6 mg / kg) ve tiletamin artı zolazepam (/ kg 18 mg) kas içine enjeksiyonu ile 12 haftalık erkek Sprague-Davvley sıçanları anestezisi. Yavaşça cilt seğirmesi yokluğunda uygun anestezi onaylamak için hayvanların derisini çimdik.
2. Göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için her sıçanın sağ gözüne% 0.5 proparacaine hidroklorür bir damla aşılamak. Aşılamaksol göze tetrasiklin merhem kornea kuruluğunu önlemek için.
3. sıvı nitrojen içinde paslanmaz çelikten bir prob (çap = 3 mm) soğutun. 30 sn sağ gözünün kornea santralinde paslanmaz çelik prob uygulayın. Sıkça kornea kuruluğunu önlemek için işlem sırasında sağ gözüne PBS aşılamak.
4. hemen cryoinjury sonra% 0.1 atropin ve% 0.3 gentamisin sülfat aşılamak ve günde bir kez siliyer spazm kaynaklanan göz ağrısı rahatlatmak için ve enfeksiyonu önlemek için.
   1. İşlemden sonra, sıçanlar bir ısı lambası kullanarak sıcak tutmak ve onlar motor kontrolünü yeniden kadar anestezi sonrası kendi iyileşme her 15 dakika gözlemleyin. Ayrıca, iyileşme döneminde kornea kuruluğunu önlemek için sağ gözüne tetrasiklin merhem uygulayın.
5. 3 gün üst üste kornea cryoinjury tekrarlayın.
6. Daha önce açıklandığı gibi sıçan gözlerin ön odasına marimastat veya bFGF verilmesi için, fareler uyutmak. bir damla aşılamaksağ göz içine% 0.5 proparacaine hidroklorür göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için.
7. steril PBS ile göz yüzeyi yıkayın. iris yukarıda ve paralel bir düzlemde paralimbal açık bir korneadaki bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne sokarak bir ameliyat mikroskobu altında Ön bölme parasentezi gerçekleştirmek.
8. İğne yukarı konik çevirin ve hafif bazı sulu mizah drenaj ve göz içi basıncını düşürmek için kornea yara bastırın. intrakameral ilacın 0.02 ml enjekte edilir. Yavaşça iğne çekilmesi sırasında pamuk uçlu iğne yolu sıkıştırmak.
9. ameliyat mikroskobu altında belirtilen zaman noktasında dış göz fotoğraf.

3. Hasat Sıçan Kornea Düğme ve immün

1. Fareleri euthanize için, ötenazi odasına koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO ₂ demlenmeye. Bir CO ₂ infüzyon korumaksolunum yetersizliği ve soluk göz rengi sonra ek dakika.
2. keskin bir bıçak ile limbusta sıçan göz nüfuz eder. limbusta boyunca kornea makasla korneaları kesin. bir slayt korneaları dümdüz. korneaları kıvrılıp, ek radyal kesiler olun.
3. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile kornealar düzeltildi. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği, ve 30 dakika boyunca,% 10 büyükbaş hayvan serum albümini ile bloke eder.
4. 1 oranında sulandırılmış bir gece boyunca 4 ° C 'de ABC karşı birincil antikor ile kornealar inkübe: 200 antikoru seyreltici içinde. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez kornealar yıkayın ve ikincil antikor ile inkübe: 1 saat süre ile oda sıcaklığında (1 antikoru seyreltici içinde, 100). Hücre 2 ug 4 / ml ', 6-diamidino-2-fenilindol ile hücrelerin kaplayarak nükleus ve 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri Counterstain.
5. montaj çözümü, anti-solmaya korneaları monte edin. ob20X objektif büyütme bir lazer tarama konfokal mikroskop ile immunofluorescent 405 uyarma dalga boylarındaki görüntüleri ve 561 nm tain.

Sonuçlar

Sığır CECS izole edildikten sonra, hücreler, in vitro olarak kültürlendi. 1 sığır CDKÖ faz kontrast görüntüler sunar Şekil. Izdiham hücrelerin altıgen şekil hücreleri hücre izolasyonu sırasında kornea stromal fibroblast tarafından kontamine olmadığını belirtti. 2 belirtilen bir zaman noktasında ABC, salyangoz ve sümüklü böcek karşı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir immün tasvir

Tartışmalar

CESler hücre proliferasyonu sırasında EnMT geçmesi için kendi eğilimi bilinmektedir. Tedavi amaçlı EnMT sürecini bastırmak için stratejiler geliştirmek, EnMT mekanizmasının tam bir anlayış gereklidir. Biz EnMT, in vitro kültür modeli ve sıçan kornea endotel cryoinjury modelinde yani sığır CEC araştırmak için 2 modeller nitelendirdi. Bizim sonuçları Her iki modelde de EnMT süreci göstermiştir. Ayrıca, marimastat ve EnMT baskılayıcı etkisi bu 2 model aynı mekanizmayı ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug