فأري موديل التجريبية التنمية الورم الأصلي والبريتوني ورم خبيث<em&gt; عبر</em&gt; مثلي تلقيح مع خلايا المبيض سرطان

Summary

لتوضيح عملية متعددة الخطوات لنشر البريتوني من سرطان المبيض، تقدم الدراسة الحالية نموذج تجريبي الفئران من نمو الورم الأصلي والانبثاث البريتوني عن طريق التلقيح مثلي مع هذه الخلايا السرطانية.

Abstract

ويرتبط سرطان المبيض الظهاري (EOC) مع بسوء التشخيص لأنه يظهر نشر البريتوني. لتحسين أحوال الطقس، فمن المهم للسيطرة على نشر البريتوني. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تنفصل الخلايا السرطانية من الآفات الأولية ونعلق على ميسوثيليوم. هناك حاجة إلى إنشاء نموذج حيواني المناسب لفهم آلية نشر البريتوني في الجسم الحي. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم العملية من حقن المحلية من خلايا EOC إلى سطح المبيض الفئران لنمو الانبثاث، بما في ذلك الصفاق وأعضاء بعيدة. واستخدمت الفئران عارية الإناث (BALB / ج نو / نو) في 8 أسابيع من العمر. تحت حقل المجهري للعرض، خلايا EOC (1 × 10 ⁵ خلية / ميكرولتر من المصفوفة المتوسطة خارج الخلية (ECM) القائم على هيدروجيل / المبيض من طرف واحد / الماوس) تم حقنه في الفئران المبايض من خلال نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية. هذه الطريقة المقترحة هو جنيهSS إجراء الغازية للماوس، ويقلل من الأضرار التي لحقت المبيض. هنا، نحن تصف الخطوات المنهجية في تطوير تشكيل الورم الأصلي والمنتشر من مركز عمليات الطوارئ.

Introduction

طلائي سرطان المبيض (EOC) يمثل أعلى نسبة من الوفيات الناجمة عن السرطان بين الأورام الخبيثة أمراض النساء ^1. ويرتبط مركز عمليات الطوارئ مع تكهن الفقراء، ويرجع ذلك أساسا إلى أواخر الأعراض لها، وكثيرا ما يرتبط مع disseminations داخل الصفاق متعددة وبعيدة الانبثاث ^2-4. نشر البريتوني هو عملية متعددة الخطوات. أولا، الخلايا السرطانية فصل من الآفات الأولية، وتهاجر إلى تجويف البطن. عندما نعلق على الخلايا السرطانية في ميسوثيليوم البريتوني، أنها بداية لغزو الأنسجة من خلال ميسوثيليوم ^5،6. من أجل فهم أفضل للورم البيولوجيا (على سبيل المثال، تقدم السرطان والاستجابة العلاجية)، وتقدم نماذج الماوس على ثروة من المعلومات. ويستخدم على نطاق واسع وطعم أجنبي مع خلايا سرطانية بشرية لنماذج الماوس التي يتم فيها تلقيح خلايا سرطانية بشرية تحت الجلد، داخل الصفاق، عن طريق الوريد، وorthotopically. نموذج حيواني مع ز orthotopicallyورم رافتيد يمكن أن تولد أكثر كفاءة ودقة النتائج التي تعكس البيئة ورم في البشر بالمقارنة مع نموذج حيواني مع ورم المطعمة heterotopically. لذلك، بالنسبة لكثير من الأورام البشرية، تم إنشاء نماذج زرع مثلي ^7-11.

هنا، نحن تصف التلقيح مثلي الخلايا EOC الإنسان من خلال نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية، الذي الغازية محدودة مقارنة التلقيح بطني. هذه التقنية يمكن أن توفر مجموعة متنوعة من المعلومات المفيدة عن مركز عمليات الطوارئ، وخاصة آلية نشر داخل الصفاق.

Protocol

يتبع بروتوكول العلاج المبادئ التوجيهية لإجراء التجارب على الحيوانات من جامعة ناغويا المعتمدة.

1. إعداد تعليق خلية

1. واضح خط سرطان الخلايا المبيض البشري الخلية.
   1. الحفاظ ES-2 خلايا ¹² في المتوسط RPMI-1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (البنسلين: 100 وحدة / مل، الستربتومايسين: 0.1 ملغ / مل). ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ حاضنة مرطب.
   2. جمع الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي في التربسين 0.05٪ / 0.02٪ EDTA الحل (التربسين / EDTA).
      1. أولا، إزالة وسائل الإعلام القديمة من سفينة الثقافة الخلية، ثم يغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (PBS دون الكالسيوم ²⁺ / المغنيسيوم ^2+، 3-4 مل لكل 25 سم ^2).
      2. التالي، إضافة 1 مل لكل 25 سم ² من التربسين / EDTA. تدوير سفينة الثقافة خلية لتغطية أحادي الطبقة الخلية مع التربسين / EDTA. بعد إزالة والتخلص التربسين / EDTA، والعودة الخليةوفصل 5 دقائق أو حتى خلايا - سفينة الثقافة إلى الحاضنة لمدة 3.
      3. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من فصل الخلايا من سطح السفينة زراعة الخلايا والعائمة.
      4. إضافة مصل الطازجة التي تحتوي على متوسط النمو لإبطال نشاط التربسين (5 مل لكل 25 سم ^2)، وإعادة تعليق الخلايا. نقل إعادة علقت الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
      5. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. أداء الطرد المركزي إما في 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية طاف وإعادة تعليق الخلايا مع متوسط نمو (5 مل لكل 25 سم ^2).
   3. عدد الخلايا (على سبيل المثال، من خلال استبعاد التريبان الأزرق) ثم إعادة تعليق في متوسط النمو في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁸ خلية / مل. وضع خلايا علقت على الجليد.
2. ذوبان المصفوفة خارج الخلية المجمدة (ECM) المستندة قسامات هيدروجيل في حمام الثلج.
3. إضافة تعليق الخلية إلى قسامات هيدروجيل أساس ECM-في نسبة 1: 1 (النهائية الخلية جoncentration: 1 × 10 ⁵ خلية / ميكرولتر من هيدروجيل مقرها المتوسطة ECM) وتخلط جيدا. ضع تعليق خلية مستعدة في حمام الثلج حتى الاستخدام.

2. مثلي التلقيح مع تعليق خلية

ملاحظة: جراحة لا يحتاج الى جناح مخصص. الجراحة يمكن أن يؤديها على الفوق المختبر في منطقة من الغرفة غير منفصل ولديه الحد الأدنى من النشاط. كما يمكن استخدام غطاء محرك السيارة الصفحي. يجب استخدام الأدوات الجراحية المعقمة ومقص لا ينبغي أن تستخدم لجعل شقوق الجلد.

1. استخدام الفئران عارية الإناث (BALB / ج نو / نو) في 8 أسابيع من العمر لهذا النموذج التلقيح مثلي.
2. أولا، تخدير الماوس باستخدام استنشاق مع isoflurane (2-4٪). تحقق عمق التخدير عن طريق التأكد من عدم وجود سحب على قرصة اصبع القدم الراسخة. بعد تخدير الماوس، وتطبيق مرهم معقم لطيف للعيون لمنع جفاف عند الضرورة.
3. ضع الماوس تخدير على أبرتجي مرحلة جنب البطن إلى أسفل. تطهير المنطقة الجراحية عدة مرات مع كل من الكحول وفرك المستندة إلى بالكلورهيكسيدين القائم على اليود أو.
4. جعل شق ~ 2 سم عموديا بالقرب من العمود الفقري بين قوس الضلع الأيمن والفخذ. استخدام ثنى الجراحية المعقمة حول موقع شق. إصلاح أسطح الجلد قطعي مع المشابك للحفاظ على الافتتاح.
   ملاحظة: الكامشات يمكن استخدامها بدلا من المشابك.
5. بعد ذلك، وجعل شق الثاني (حوالي 1 سم) في الصفاق الجداري تحت شق الأول لفتح تجويف البطن. المشبك السطوح البطن قطعي. مقطع الأنسجة الدهنية التي تحيط أنبوب المبيض وقناة فالوب المماثل مع المشبك لإزالة المبيض من تجويف البطن. وضع بعناية المبيض وقناة فالوب على الشاش. ثم، ضع الماوس على جانب البطن إلى أسفل تحت المجهر تشريح.
6. ضع تعليق خلية في حقنة الأنسولين (1/2 سم مكعب، 29 G) قبل الحقن. حقن بعناية تعليق خلية استعداد (1- 2 ميكرولتر) في المبيض. لعدة ثوان، الإبقاء على إبرة داخل المبيض لضمان دبق من هيدروجيل القائم على ECM. بعد دبق، تبقى الخلايا السرطانية حقن داخل المبيض.
7. بعناية العودة المبيض في الجسم. خياطة الشق الثاني مع الحرير الطبي المعقم، ثم ختم الجلد مع مقاطع الجرح.
8. بعد الجراحة، وسوف تدار الفئران لتسكين الألم (على سبيل المثال، ميلوكسيكام، العضل (ايم) أو تحت الجلد (SC)، 0.2 ملغ / كلغ) لالأولية فترة 24 ساعة.

العلاج 3. مرحلة ما بعد العمليات الجراحية

1. وضع كل الماوس في قفص منفصل على ورقة نظيفة مع حزمة الساخنة للحفاظ على الحارة الماوس حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. ثم، وعودة الحيوانات إلى أقفاصها للتربية والرصد. مراقبة الفئران يوميا لمدة 3-7 أيام بعد العلاج الجراحي.
2. رصد الفئران بعد العملية الجراحية
   1. في حالة علامات الألم وإدارة analgeSICS يوميا (على سبيل المثال، ميلوكسيكام، والتراسل الفوري أو الشوري، 0.2 ملغ / كلغ).
   2. إذا توجد لدى الفئران علامات للعدوى (على سبيل المثال، احمرار، تورم والتفريغ)، إدارة الحقن اليومي مع كاشف المضادة للعدوى (على سبيل المثال، البنسلين، والتراسل الفوري، 100000 وحدة دولية / كغ).
3. إزالة المواد إغلاق الجلد 10-14 أيام بعد تلقي العلاج بعد الجراحة.

4. تحليل الأورام والانبثاث

ملاحظة: سيتم تشكيل ورم في المبيض 2 حقن - 3 أسابيع بعد التلقيح.

1. التضحية الفئران عن طريق غاز ثاني أكسيد الكربون، ومن ثم جمع عينات (على سبيل المثال، والأورام، الانبثاث، أجهزة) ^13-15 لمزيد من التحليل ^14،16-20.
   ملاحظة: إذا كان في الجسم الحي نظام التصوير متاح، والخلايا التي تحمل الإنزيمات التي تنتج تلألؤ بيولوجي (على سبيل المثال، وسيفيراز) أو بروتين فلوري (على سبيل المثال، GFP) يمكن استخدامها في هذا البروتوكول. وهذا البروتوكول المعدل يوفر معلومات مفيدة للديناميات انتشار الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي.

النتائج

وكان ستة الفئران عارية المبيضين تلقيح مع واضحة خط خلية سرطان الخلايا البشرية ES-2، كما هو موضح في هذا البروتوكول. كما هو مبين في الشكل 1A، 2 بعد أسابيع، وكان 5 من 6 الفئران ورم في المبيض تلقيح مع خلايا ES-2، ولكن لم يكن هناك ورم في المبيض المقاب?...

Discussion

النماذج الحيوانية ضرورية لتحليل آليات التنمية الورم، والتقدم، ورم خبيث، وفعالية الدواء ضد الخلايا السرطانية. كما استخدمت الفئران الحاملة لخلايا سرطان المبيض الإنسان كنموذج للحيوانات. هنا، نحن تصف إجراء أقل الغازية لإدارة الخلايا السرطانية في المبيض في موقع مثلي. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel matrix	BD	354234	ECM-based hydrogel
Insulin syringe	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture			11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip Applier	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm wound clips	CellPoint Scientific	203-1000