Мышиные Экспериментальная модель самобытного развития опухолевого и перитонеальный метастаз<em&gt; с помощью</em&gt; Ортотопическая Заражение клеток карциномы яичников

Резюме

Для уточнения многоэтапный процесс брюшины распространения рака яичников, текущее исследование представляет собой мышиный экспериментальную модель развития первичной опухоли и метастазов с помощью перитонеального ортотопической прививки с этими опухолевыми клетками.

Аннотация

Эпителиальный рак яичников (EOC) ассоциируется с плохим прогнозом, поскольку он показывает перитонеальный распространение. Чтобы улучшить прогноз, важно контролировать перитонеальный распространение. Тем не менее, до сих пор неясно, как опухолевые клетки отделяются от первичных повреждений и прикрепить к мезотелием. Создание соответствующей животной модели необходимо , чтобы получить представление о механизме распространения брюшную в естественных условиях. В настоящем исследовании мы вводим процесс из локальной инъекции клеток EOC в мышиной яичников поверхности к развитию метастаз, включая брюшину и отдаленные органы. использовали женских особей голых мышей (BALB / C Nu / Nu) в возрасте 8 недель. Под микроскопического поля зрения, EOC клетки (1 х 10 ⁵ клеток / мкл среднего внеклеточного матрикса (ЕСМ) основе гидрогеля / одностороннее яичник / мышь) вводили в мышиные яичниках через забрюшинного подход со стороны спинного фланга. Этот предложенный метод является лесс инвазивная процедура для мыши и сводит к минимуму повреждения яичника. Здесь мы описываем методологические шаги в развитии оригинального и метастатического формирования опухоли EOC.

Введение

Эпителиальный рак яичников (EOC) приходится самый высокий уровень заболеваемости раком , связанных с смертности среди гинекологических злокачественных опухолей ^1. EOC ассоциируется с плохим прогнозом, в первую очередь из - за его позднего симптоматики, и часто ассоциируется с множественными внутрибрюшинных вкраплениями и отдаленных метастазов ^2-4. Перитонеальный распространение является многоступенчатым процессом. Во-первых, опухолевые клетки отделяются от первичных поражений, и мигрируют в брюшную полость. Когда опухолевые клетки прикрепляются к перитонеальной мезотелием, они начинают вторгаться ткани через Мезотелия ^5,6. Для того , чтобы лучше понять биологию опухоли (например, прогрессирование рака и терапевтический ответ), мышиные модели обеспечивают большой объем информации. Ксенотрансплантата с раковыми клетками человека широко используется для моделей мышей, в которых раковые клетки человека, привитых подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, и ортотопически. Модель животных с ортотопически гсплавлялись опухоль может более эффективно и точно получать результаты, которые отражают окружающую среду опухоли у человека по сравнению с животной модели с гетеротопически привитой опухолью. Таким образом, для многих опухолей человека, Ортотопическая модели трансплантации были созданы ^7-11.

Здесь мы опишем ортотопическая инокуляции клеток EOC человека через забрюшинного подход со стороны спинного фланг, который имеет ограниченную инвазивность по сравнению с вентральной прививкой. Этот метод может обеспечить разнообразие полезной информации о ЕОС, особенно механизм внутрибрюшинного распространения.

протокол

Протокол лечения следует рекомендациям для экспериментов на животных, принятого Нагойского университета.

1. Приготовление Суспензии клеток

1. Человек яичников ясно, клеточная линия клеточный рак.
   1. Поддерживать клетки ¹² ES-2 в среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и пенициллин / стрептомицин (пенициллин: 100 ед / мл, стрептомицин: 0,1 мг / мл). Культуры клеток при 37 ° С в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе.
   2. Собирают клетки в логарифмической фазе роста в 0,05% трипсина / 0,02% раствор ЭДТА (трипсин / ЭДТА).
      1. Во- первых, удалите старые носители из сосуда для культивирования клеток, а затем промыть клетки один раз PBS (PBS без Ca ²⁺ / Mg ^2+, 3 - 4 мл на 25 см ^2).
      2. Затем добавьте 1 мл на 25 см ² трипсина / ЭДТА. Поворот сосуда для культивирования клеток, чтобы покрыть клеточный монослой с трипсин / ЭДТА. После удаления и отбрасывая трипсин / ЭДТА, возвращают в клеткукультуральный сосуд в инкубаторе в течение 3 - 5 мин или до клетки отделяются.
      3. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы обеспечить клетки отделяются от поверхности сосуда для культивирования клеток и плавающей.
      4. Добавить свежую сыворотку , содержащую ростовую среду для инактивации трипсина (5 мл на 25 см ^2), и повторно приостанавливать клетки. Передача ресуспендировали клеток в 15 мл коническую пробирку.
      5. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин. Выполните центрифугирование либо при 4 ° С или при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант и повторно приостанавливать клетки с ростовой среды (5 мл на 25 см ^2).
   3. Граф клеток (например, путем трипанового-синего исключения) , а затем повторно приостанавливать в среде роста при плотности 2 × 10 ⁸ клеток / мл. Поместите приостановленные клетки на льду.
2. Размораживайте внеклеточного матрикса (ECM) основе гидрогеля аликвот в бане со льдом.
3. Добавить клеточной суспензии ЕСМ на основе гидрогеля аликвот при соотношении 1: 1 (окончательный сота Concentration: 1 × 10 ⁵ клеток / мкл среднего ECM на основе гидрогеля) и тщательно перемешать. Поместите подготовленные клеточные суспензии в бане со льдом до использования.

2. Ортотопическая Прививка с Суспензии клеток

Примечание: Операция не требует специального набора. Операция может быть выполнена на лабораторных стендовых испытаний в зоне комнаты, отделенной и имеет минимальную активность. Ламинарный капот также может быть использован. Стерильные хирургические инструменты должны быть использованы и ножницы не должны использоваться, чтобы делать надрезы кожи.

1. Использование женских особей голых мышей (BALB / с ню / ню) в возрасте 8 недель для этой ортотопической прививка.
2. Во-первых, обезболить мышь с помощью ингаляции с изофлуран (2 - 4%). Проверьте глубину анестезирующего средства, проверив отсутствие вывода при носке фирмы крайнем случае. После того, как мышь под наркозом, нанесите мягкий стерильный глазной мази для глаз, чтобы предотвратить высыхание по мере необходимости.
3. Поместите наркозом мыши на OPERATING стадии живот стороной вниз. Лечить хирургической области несколько раз как алкоголя, так и на основе йода или хлоргексидина на основе скраба.
4. Сделать ~ 2 см разрез по вертикали вблизи позвоночника между правом подреберье и бедренной кости. Используйте стерильные хирургические драпировка вокруг места надреза. Закрепить врезанные поверхности кожи с помощью зажимов для поддержания отверстия.
   Примечание: Ретракторы можно использовать вместо зажимов.
5. Затем сделайте второй надрез (примерно 1 см), при париетальной брюшины в рамках первого разреза, чтобы открыть брюшной полости. Зажим врезанные брюшной поверхности. Клип жировой ткани, которая окружает ипсилатерального яичников и фаллопиевых труб с зажимом, чтобы удалить яичник из брюшной полости. Осторожно поместите яичник и фаллопиевых труб на марлю. Затем поместите мыши живот стороной вниз под рассекает микроскопом.
6. Поместите суспензию клеток в инсулиновый шприц (1/2 куб.см, 29 г) непосредственно перед инъекцией. Тщательно впрыснуть полученной суспензии клеток (1- 2 мкл) в яичниках. В течение нескольких секунд, сохраняют иглу в яичнике, чтобы обеспечить гелеобразование ECM на основе гидрогеля. После гелеобразования, инъецированные опухолевые клетки остаются внутри яичника.
7. Осторожно вернуть яичник в организм. Шовный второй надрез стерильного медицинского шелка, а затем запечатать кожи с намотанными зажимами.
8. После операции мышам вводят анальгезию (например, мелоксикам, внутримышечной (IM) или подкожного (SC), 0,2 мг / кг) в течение начального периода 24 ч.

3. Послеоперационное лечение

1. Поместите каждую мышь в отдельной клетке на чистой бумаге с горячей пакет, чтобы держать в тепле мыши, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Затем вернуть животных в их клетки для выращивания и мониторинга. Монитор мышей ежедневно в течение 3 - 7 дней после хирургического лечения.
2. Мониторинг послеоперационного мышей
   1. В случае появления признаков боли, управлять analgeSICS ежедневно (например, мелоксикам, внутримышечно или подкожно, 0,2 мг / кг).
   2. Если у мышей есть признаки инфекции (например, покраснение, припухлость, разряда), администрирование ежедневной инъекции с антиинфекционной реагента (например, пенициллин, им, 100000 МЕ / кг).
3. Удалить Закрытие кожи материалов 10 - 14 дней после того, как после хирургического лечения.

4. Анализ опухолей и метастазов

Примечание: опухоль будет формироваться на инжектированных яичник 2 - 3 недели после прививки.

1. Жертвоприношение мышей с помощью диоксида углерода, а затем собирать образцы (например, опухоли, метастазы, органов) ^13-15 для дальнейшего анализа ^14,16-20.
   Примечание: Если система формирования изображения в естественных условиях доступно, клетки , несущие ферменты , которые производят биолюминесценции (например, люциферазы) или флуоресцентный белок (например, GFP) , могут быть использованы в данном протоколе. Этот модифицированный протокол будет предоставлять полезную информацию длядинамика распространения раковых клеток из первичной опухоли.

Результаты

Шесть голых мышей имели яичники заражают человека светлоклеточный клеточной линии карциномы ES-2, как описано в данном протоколе. Как показано на рисунке 1А, через 2 недели, 5 из 6 мышей была опухоль в яичнике инокулировали клетками ES-2, но не было никакой опухо...

Обсуждение

Модели на животных имеют важное значение для анализа механизмов развития опухоли, прогрессии, метастазировании и эффективности лекарственного средства против раковых клеток. Мыши, несущие клеток рака яичников человека также были использованы в качестве животной модели. Здесь мы опи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel matrix	BD	354234	ECM-based hydrogel
Insulin syringe	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture			11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip Applier	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm wound clips	CellPoint Scientific	203-1000