JoVE Logo

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

초록

이 복막 보급을 보여주기 때문에 상피 난소 암 (EOC)는 불량한 예후와 연관되어있다. 예후를 개선하기 위해, 복막 보급을 제어하는 ​​것이 중요하다. 종양 세포는 일차 병소에서 분리 및 부착 방법 mesothelium 그러나, 여전히 불분명하다. 적절한 동물 모델의 확립은 생체 내에서 복막 보급의 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 현재의 연구는 복막과 원격 장기 포함한 전이 현상에 쥐 난소 표면에 EOC 세포의 국소 주입의 과정을 소개한다. 나이 8 주째 암컷 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 민)를 사용 하였다. 보기의 현미경 분야에서 EOC 세포 지느러미 측면에서 후 복막 접근 방식을 통해 쥐의 난소에 주입했다 (중간 세포 외 기질 (ECM)의 1 × 10 5 세포 / μL은 하이드로 겔 / 일방적 인 난소 / 마우스 기반). 이 제안 된 방법은 르입니다마우스에 대한 SS 침략 절차 및 난소의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 여기서는 EOC 원래 전이성 종양 형성의 개발 방법 론적 단계를 설명한다.

서문

상피 난소 암 (EOC)는 부인과 악성 종양 1 중 암 관련 사망의 가장 높은 비율을 차지. EOC는 주로 인해 늦게 증상으로, 예후와 연관되어, 종종 여러 복강 내 disseminations 및 원격 전이 2-4와 연결되어 있습니다. 복막 전파는 다단계 프로세스이다. 우선, 종양 세포는 일차 병소에서 분리 및 복강 내로 이동한다. 종양 세포가 복강 mesothelium에 부착되면, 그들은 mesothelium 5,6- 통해 조직을 침범하기 시작한다. 더 나은 종양 생물학 (예를 들어, 암의 진행 및 치료 반응)을 이해하기 위해서는, 마우스 모델은 풍부한 정보를 제공합니다. 인간 암세포와 이종 널리 인간 암세포를 복강 내, 정맥 내 및 동소 피하 접종 된 마우스 모델을 사용한다. 동소의 g를 가진 동물 모델뗏목 종양보다 효율적이고 정확하게 heterotopically 그래프트 종양 동물 모델에 비해 인간 종양 환경을 반영하는 결과를 생성 할 수있다. 따라서, 많은 인간의 종양, 동 소성 이식 모델은 7-11 설립되었습니다.

여기, 우리는 복부 접종에 비해 침입이 제한 지느러미 측면에서 복막 접근을 통해 인간의 EOC 세포의 동 소성 접종에 대해 설명합니다. 이 기술은 EOC에 유용한 정보, 복강 보급 특히기구의 다양한 기능을 제공 할 수있다.

프로토콜

치료 프로토콜은 나고야 대학에 의해 채택 된 동물 실험에 대한 가이드 라인을 따른다.

세포 현탁액 1. 준비

  1. 인간의 난소 투명 세포 암 세포주.
    1. (100 단위 / ㎖, 스트렙토 마이신 0.1 ㎎ / ㎖ 페니실린) 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신을 가진 RPMI-1640 배지에서 ES-2 셀 (12)을 유지한다. 5 % CO 2 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 세포.
    2. 0.05 %의 트립신 / 0.02 %의 EDTA 용액 (트립신 / EDTA)를 대수 증식기의 세포를 수집한다.
      1. (- 25cm 2 당 4 ml의 2 + 칼슘 / 마그네슘없이 PBS 3) 먼저, 다음 PBS로 한 번 세포를 씻어, 세포 배양 용기에서 이전 용지를 제거합니다.
      2. 다음으로, 25cm 트립신 / EDTA 2 당 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 트립신 / EDTA로 세포 단층을 포함하는 세포 배양 용기를 돌린다. 제거하고 트립신 / EDTA를 폐기 한 후, 세포를 반환3 인큐베이터에 배양 용기 - 세포 5 분 또는 때까지이 분리된다.
      3. 현미경으로 세포를 검사하는 세포는 세포 배양 용기 및 부동의 표면으로부터 분리되도록한다.
      4. 트립신 (25cm이 당 5 ㎖)를 불 활성화하고, 세포를 다시 일시 성장 배지를 함유하는 신선한 혈청에 추가. 15 ML 원뿔 관에 다시 정지 세포를 전송합니다.
      5. 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 4 °의 C 또는 실온에서 원심 분리를 수행합니다. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 (25cm 2 당 5 ㎖) 성장 매체와 세포를 일시 중지 다시.
    3. (트리 판 블루 배제에 의해 예) 세포를 계산 한 다음 2 × 108 세포 / ㎖의 밀도로 성장 배지에 재현 탁. 얼음에 일시 중단 된 세포를 넣습니다.
  2. 해동 냉동 세포 외 기질 (ECM)의 빙욕에서 하이드로 겔 분취 기반.
  3. 1 (최종 셀 (C) : 1의 비율로 ECM 계 하이드로 겔 분취 량의 세포 현탁액을 추가oncentration : 1 × 10 5 세포 / 중간 ECM 기반의 하이드로 겔의 μL)하고 철저하게 섞는다. 사용할 때까지 얼음 용기에 제조 된 세포 현탁액을 놓습니다.

세포 현탁액 2. 동소 이식 접종

참고 : 전용 제품군을 필요로하지 않는다 수술. 수술 별도 최소 활성을 갖는 실내 영역에서 실험실 벤치 탑상에서 수행 될 수있다. 층류 후드도 사용될 수있다. 무균 수술 도구가 사용되어야하며 가위는 피부 절개를 만들기 위해 사용할 수 없습니다.

  1. 이 소성을 접종 모델에 대한 연령 8 주에서 여성 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 뉴)를 사용합니다.
  2. (- 4 %, 2) 우선, 흡입 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 회사 발가락 핀치에 따라 철수의 부족을 확인하여 마취 깊이를 확인합니다. 마우스를 마취 한 후, 필요에 따라 건조 방지하기 위해 눈에 개성 멸균 안과 연고를 적용합니다.
  3. 조작하기에 마취 마우스를 놓습니다아래 단계의 배 쪽을 보내고. 외과 영역을 알코올과 요오드 계 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽 모두 여러 번 소독.
  4. 수직으로 오른쪽 늑골 아치와 대퇴골과 척추 근처 ​​~ 2 cm의 절개를합니다. 절개 부위 주변의 무균 수술 드레이프를 사용합니다. 개방을 유지하기 위해 클램프와 절개 피부 표면을 수정합니다.
    주 : 견인기 대신 클램프 사용될 수있다.
  5. 다음으로, 복강을 열고 첫 번째 절개에서 정수리 복막에서 두 번째 절개 (약 1cm)를 확인합니다. 절개 복부 표면을 클램프. 복강에서 난소를 제거하는 클램프 동측 난소 및 나팔관 주위의 지방 조직을 클립. 조심스럽게 거즈에 난소 및 나팔관을 배치합니다. 그 후, 해부 현미경으로 마우스의 배 쪽을 아래로 놓습니다.
  6. 바로 주입하기 전에 (1/2 CC, 29 G) 인슐린 주사기의 세포 현탁액을 놓습니다. 조심스럽게 준비된 세포 현탁액을 (주사 1- 난소에 2 μL). 몇 초를 들어, ECM 계 하이드로 겔의 겔화를 위해 난소 내 바늘을 보유한다. 겔화 후, 주입 된 종양 세포는 난소 안에 남아있다.
  7. 조심스럽게 몸에 난소를 돌려줍니다. 멸균 의료 실크와 두 번째 절개를 봉합하고 상처 클립으로 피부를 밀봉.
  8. 수술 후 생쥐의 초기 24 시간의 기간 동안 진통제 (예를 들어, 멜 록시 캄, 근육 내 (IM) 또는 피하 (SC), 0.2 ㎎ / ㎏)을 투여한다.

3. 후 수술 치료

  1. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 뜨거운 팩을 깨끗한 종이에 별도의 장에 각 마우스를 놓습니다. 그런 다음, 양육 및 모니터링을 위해 자신의 새장에 동물을 반환합니다. 수술 적 치료 다음 칠일 - 3 매일 쥐를 모니터링합니다.
  2. 수술 후 마우스의 모니터링
    1. 고통의 흔적의 경우, analge 관리SICS 매일 (예를 들어, 멜 록시 캄, 메신저 또는 SC / kg, 0.2 mg)을 얻었다.
    2. 마우스 감염 (예를 들어, 발적, 부종, 방전)의 흔적이있는 경우, 항 감염 시약 (예, 페니실린, 메신저, 100,000 IU / kg)을 매일 주사를 관리 할 수 있습니다.
  3. 수술 치료 후 14 일 - 피부 폐쇄 재료 (10)를 제거합니다.

종양과 전이 4. 분석

주 : 종양이 주입 된 난소이 형성됩니다 - 접종 후 삼주.

  1. 이산화탄소에 의한 쥐를 희생하고 추가 분석을 14,16-20에 대한 샘플 (예를 들어, 종양, 전이, 기관) 13-15를 수집합니다.
    주 : 생체 내 이미징 시스템이 제공되는 경우, 생물 발광 (예 : 루시 페라 제) 또는 형광 단백질 (예 : GFP)를 생성하는 효소 담 셀이 프로토콜에서 사용될 수있다. 이 수정 된 프로토콜에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다일차 종양 암 세포의 확산의 역학.

결과

여섯 누드 마우스는이 프로토콜에 기재된 바와 같이 난소가 인간 투명 세포 암종 세포주 ES-2로 접종했다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 1 주 후 6 마우스의 5 ES-2 세포에 접종 난소 종양을 가졌으나 (대조군으로서 사용됨) 접종하지 않고 반대측 난소에는 종양이 없었다. 또한, 5 쥐의 2 복수 여러 복막 disseminations을 보였다. 세포는 간 (그림 1B)로 전?...

토론

동물 모델은 암 세포에 대해 종양 발달 진행, 전이, 약물 효능의 기전을 분석하기 위해 필수적이다. 인간 난소 암 세포를 담지 마우스는 동물 모델로서 사용되어왔다. 여기서, 우리는 동소 사이트 난소 종양 세포의 투여에 덜 침습적 인 과정을 설명한다. 지느러미 측면에서 후 복막 접근 방식을 통해 난소에이 절차 접종을 사용하면 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공한다. ...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

저자는 도움이 토론 및 기술 지원에 대한 산부인과의 부서의 구성원과 암 생물학 감사합니다. 이 연구는 과학의 진흥 (JSPS)에 대한 일본 사회에 의해 지원되었다 그랜트 -에 - 보조 과학 연구 (15K15604, H. Kajiyama에).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Matrigel matrix BD354234ECM-based hydrogel
Insulin syringeTERUMOSS-05M29131/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip ApplierCellPoint Scientific204-1000
 Reflex 7 mm wound clipsCellPoint Scientific203-1000

참고문헌

  1. Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 61 (2), 69-90 (2011).
  2. Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
  3. Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
  4. Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
  5. Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
  6. Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
  7. Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
  8. Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
  9. Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
  10. Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
  11. Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
  12. Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
  13. Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
  14. Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
  15. Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
  16. Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
  17. Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
  18. Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
  19. Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
  20. Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
  21. Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

118EOC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연구

교육

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유