Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Özet

over kanseri periton yayılması çok adımlı süreci açıklamak için, mevcut çalışma bu tümör hücreleri ile ortotopik aşılamadan yoluyla orijinal tümör gelişimi ve periton metastazı bir fare deneysel modeli sunar.

Özet

o periton yayılmasını gösterir çünkü Epitelyal over kanseri (EOC) kötü prognoz ile ilişkilidir. prognozu iyileştirmek için, periton yayılmasını kontrol etmek önemlidir. Tümör hücreleri primer lezyonlardan ayırmak ve mesothelium eklemek nasıl Ancak, hala belirsizdir. Uygun bir hayvan modelinin kurulması in vivo periton yayılım mekanizmasının bir anlayış kazanmak için gereklidir. Bu çalışmada, biz periton ve uzak organlara da dahil olmak üzere metastaz gelişimine fare yumurtalık yüzeyine EOC hücrelerinin lokal enjeksiyon işlemi tanıtmak. yaş 8 haftalık dişi çıplak fareler (BALB / c nu / nu) kullanılmıştır. Bir görüş mikroskobik alan altında, EOC hücreleri dorsal zayıf bir retroperitoneal yaklaşımla fare yumurtalıkların enjekte edildi (orta-ekstrasellüler matriks (ECM) 1 x 10 ⁵ hücre / ul hidrojel / tek taraflı yumurtalık / fare tabanlı). Önerilen bu yöntem le olanfare için ss invaziv prosedür ve yumurtalık zarar en aza indirir. Burada, EOC özgün ve metastatik tümör oluşumu gelişiminde metodolojik adımları açıklar.

Giriş

Epitelyal over kanseri (EOC) jinekolojik maligniteler ¹ arasında kansere bağlı ölüm oranı en yüksek oluşturmaktadır. EOC öncelikle nedeniyle geç semptomatoloji, kötü prognoz ile ilişkilidir ve genellikle birden çok intraperitoneal saçınımlı ve uzak metastaz ^2-4 ile ilişkilidir. Periton yaygınlaştırma çok adımlı bir işlemdir. İlk olarak, tümör hücrelerinin birincil lezyonlarla ayırmak ve karın boşluğuna göç ederler. Tümör hücrelerinin periton mesothelium eklemek, onlar Mesothelium ^5,6 ile dokuları işgal etmeye başlar. Daha iyi tümör biyolojisi (örneğin, kanser ilerleme ve terapötik yanıt) anlamak için, fare modelleri bilgi hazinesi sağlar. İnsan kanser hücreleri bir ksenograft yaygın insan kanser hücreleri, intraperitonal, intravenöz ve ortotopikal, deri altından aşılanır olan fare modellerinde kullanılmaktadır. Bir orthotopically g bir hayvan modelirafted tümör daha verimli ve doğru bir şekilde heterotopically aşılanmış tümörlü bir hayvan modeli ile karşılaştırıldığında insanlarda tümör ortamı yansıtan sonuçlar üretebilir. Bu nedenle, birçok insan tümörleri için, ortotopik transplantasyon modelleri ^7-11 kurulmuştur.

Burada, ventral aşılamadan oranla invazivliğini sınırlı dorsal kanadını, bir retroperitoneal yaklaşımla insan EOC hücrelerinin ortotopik aşılama açıklar. Bu teknik EOC yararlı bilgiler, periton yayılması özellikle mekanizmasının çeşitli sağlayabilir.

Protokol

Tedavi protokolü Nagoya Üniversitesi tarafından kabul edilen hayvan deney için kuralları takip eder.

Hücre süspansiyonları hazırlanması 1.

1. İnsan yumurtalık berrak hücreli karsinoma hücre hattı.
   1. (100 birim / ml streptomisin: 0.1 mg / ml penisilin),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin ile RPMI-1640 ortamı içinde ES-2 hücreleri ¹² koruyun. % 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C 'de kültür hücreleri.
   2. % 0.05 tripsin /% 0.02 EDTA çözeltisi (tripsin / EDTA) logaritmik büyüme fazında hücreler toplanır.
      1. (- 25 cm ² başına 4 ml, ^{2 +} Ca ^{2 +} / Mg olmadan PBS 3), sonra bir kez PBS ile yıkama hücreleri, hücre kültürü geminin eski ortamı çıkarın.
      2. Daha sonra, 25 cm tripsin / EDTA ^{2 'ye} 1 ml. tripsin / EDTA ile hücre mono tabakasının karşılamak için hücre kültür kabı döndürerek. kaldırma ve tripsin / EDTA atıldıktan sonra, hücre dönüş3 inkübatör kültür gemi - hücreleri 5 dakika kadar veya ayrılır.
      3. Bir mikroskop altında hücreleri incelemek hücreler, hücre kültürü damar ve yüzen yüzeyinden ayrılır sağlamak.
      4. Tripsin (25 ^cm2 başına 5 mi) inaktive ve hücrelerin yeniden askıya almak için büyüme ortamı içeren taze serum ekleyin. 15 ml konik tüp yeniden askıya hücreleri aktarın.
      5. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında santrifüjleme ya da gerçekleştirir. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve (25 cm ² başına 5 ml) büyüme ortamı ile hücreleri askıya yeniden.
   3. (Tripan mavi eksklüzyonu ile, örneğin,) hücre sayımı, daha sonra 2 x 10 ⁸ hücre / ml bir yoğunlukta büyüme ortamında yeniden askıya. buz üzerinde asılı hücreleri koyun.
2. Çözülme dondurulmuş hücre dışı matris (ECM) bir buz banyosu içinde hidrojel alikotları tabanlı.
3. 1 (nihai hücre c: 1 bir oranda ECM bazlı hidrojel alikotları hücre süspansiyonu ekleyinbağlı yoğunlaşma: 1 x 10 ⁵ hücre / orta-ECM tabanlı hidrojel ul) ve iyice karıştırın. kullanılana kadar bir buz banyosu içinde hazırlanan hücre süspansiyonları yerleştirin.

Hücre süspansiyonları, 2. Ortotopik aşılama

NOT: özel bir paketi gerektirmez Cerrahi. Cerrahi ayrı ve en az aktiviteye sahip odasının bir bölgesinde bir laboratuar sıra üzerine gerçekleştirilebilir. Bir laminar kapağı da kullanılabilir. Steril cerrahi aletler kullanılmalıdır ve makas cilt kesi yapmak için kullanılmamalıdır.

1. Bu ortotopik aşılama modeli için yaş 8 haftalık dişi çıplak farelerin (BALB / c nu / nu) kullanın.
2. (-% 4 2) İlk olarak, izofluran ile inhalasyon kullanarak fare uyutmak. Firma ayak tutam üzerine çekilmesi eksikliği doğrulayarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare uyuşturulduktan sonra, gerekli kurumasını önlemek için gözlere bir mülayim steril oftalmik merhem uygulayın.
3. Bir operat üzerinde anestezi fare yerleştirinaşağı sahne göbek tarafı ing. Cerrahi parkı alkol ve iyot bazlı veya klorheksidin bazlı fırçalayın hem birkaç kez dezenfekte edin.
4. dikey sağ kaburga kemer ve femur arasında omurga yakınında ~ 2 cm kesi olun. insizyon bölgesinde yaklaşık steril bir cerrahi örtü kullanın. açılış korumak için kelepçeler ile kazıma cilt yüzeyleri düzeltmek.
   Not: Retraktörler yerine kelepçeler de kullanılabilir.
5. Sonraki, karın boşluğu açmak için ilk kesi altında parietal periton ikinci bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapmak. çizi karın yüzeyleri kelepçe. Karın boşluğunda yumurtalık kaldırmak için bir kelepçe ile ipsilateral yumurtalık ve fallop tüpü çevreleyen yağ dokusu klibi. Dikkatle gazlı bez yumurtalık ve fallop tüpü yerleştirin. Sonra, mikroskop altında fare göbek tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin.
6. hemen enjeksiyon öncesi (1/2 cc 29 G) bir insülin şırınga hücre süspansiyonu yerleştirin. Özenle hazırlanmış hücre süspansiyonu (enjekte 1- Yumurtalık içine 2 ul). Birkaç saniye için ECM bazlı hidrojel jelleşmesini sağlamak için yumurtalık içinde iğnesinin tespit edilmesi. jelleşme sonra, enjekte edilen tümör hücreleri, yumurtalığın içinde kalır.
7. Dikkatle vücuda yumurtalık döner. steril tıbbi ipek ile ikinci kesi dikin ve sonra yara klipleri ile cilt mühür.
8. Cerrahiden sonra, farenin, ilk 24 saatlik bir süre için bir analjezik (örn, meloksikam, kas içinden (İM) ya da deri altından (sc), 0.2 mg / kg) uygulanır.

3. Post-cerrahi tedavisi

1. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar fare sıcak tutmak için sıcak bir paketi ile temiz kağıt üzerinde ayrı bir kafes içinde her fare yerleştirin. Sonra, yetiştirilmesi ve izlenmesi için kafeslerine hayvanları dönün. Cerrahi tedavi sonrası 7 gün - 3 günlük fareler izleyin.
2. Ameliyat sonrası farelerin izlenmesi
   1. ağrı belirtileri durumunda, analge idareSICS günlük olarak (örneğin, meloksikam, İM, veya SC, 0.2 mg / kg).
   2. Fareler enfeksiyon (örneğin, kızarıklık, şişlik, akıntı) belirtileri varsa, bir anti-enfektif reaktif (örn, penisilin, im, 100.000 IU / kg) ile günlük enjeksiyon yönetmek.
3. ameliyat sonrası tedavi sonrası 14 gün - cilt kapatma malzemelerdir 10 çıkarın.

Tümörlerin ve Metastazlarının 4. Analizi

NOT: Tümör enjekte over 2 oluşacaktır - aşılamadan sonra 3 hafta.

1. Karbon dioksit fareler kurban, ve daha sonra analiz için numune ^14,16-20 (örneğin, tümörler, metastazlar, organları) ^13-15 toplar.
   Not: bir in vivo görüntüleme sistemi, mevcut ise ışıldaması (örneğin, lusiferaz) ya da floresan proteini (örneğin GFP) üretimi enzimler taşıyan hücrelerin Bu protokol kullanılabilir. Bu modifiye protokol için yararlı bilgiler sağlayacaktırprimer tümörden kanser hücrelerinin yayılmasını dinamiği.

Sonuçlar

Altı çıplak fareler bu protokol açıklandığı gibi onların yumurtalıklar, insan berrak hücreli karsinom hücre hattı ES-2 ile aşılanmış vardı. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, 2 hafta sonra, 6 farelerinin 5 ES-2 hücreleri ile aşılandı yumurtalık tümör vardı, ama (bir kontrol olarak kullanılmıştır) aşılaması olmayan karşı yumurtalık tümör yoktu. Bunun yanında, 5 farelerin 2 asit ile birden periton disseminations göstermişti...

Tartışmalar

Hayvan modelleri, kanser hücrelerine karşı tümör gelişimi, ilerlemesi, metastaz ve ilaç etkinliğinin mekanizmalarını analiz için esastır. insan yumurtalık kanseri hücreleri olan farelere, aynı zamanda bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. Burada, ortotopik yerinde yumurtalık tümörü hücre uygulama için daha az invaziv bir prosedür açıklanmaktadır. dorsal zayıf bir retroperitoneal yaklaşımla yumurtalık içine bu prosedür, aşılama kullanan diğer sık ​​kullanılan tekniklere gör...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel matrix	BD	354234	ECM-based hydrogel
Insulin syringe	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture			11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip Applier	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm wound clips	CellPoint Scientific	203-1000