Murine ניסיוני דגם של התפתחות גידולים מקורית גרור הצפק<em&gt; דרך</em&gt; Orthotopic הרכבה עם קרצינומה של תאי השחלות

Summary

כדי להבהיר את תהליך רב שלבי של הפצת הצפק של קרצינומה השחלות, המחקר הנוכחי מציג מודל ניסיוני בעכברים של התפתחות גידולים המקורי וגרורות הצפק באמצעות חיסון orthotopic עם תאים סרטניים אלה.

Abstract

קרצינומה השחלות אפיתל (EOC) קשורה עם פרוגנוזה גרועה כי זה מראה הפצת הצפק. כדי לשפר את סיכויי ההחלמה, חשוב לשלוט בהפצת הצפק. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד תאים סרטניים להתנתק נגעים ראשוניים לצרף mesothelium. הקמת מודל חיה מתאים נדרשה כדי להשיג הבנה של המנגנון של הפצת הצפק in vivo. במחקר הנוכחי, אנחנו מציגים את התהליך מן הזריקה המקומית של תאי EOC לתוך שטח שחלות murine להתפתחות גרורה, כולל הצפק לאיברים מרוחקים. עכברים עירום נשי (BALB / c נו / נו) אחרי 8 שבועות של גיל היו בשימוש. תחת שדה מיקרוסקופי מבט, תאי EOC (1 x 10 ⁵ תאים / μl של מטריקס הבינוני-תאי (ECM) מבוסס הידרוג'ל / השחלה חד-צדדית / עכבר) הוזרקה השחלות בעכברים באמצעות גישת retroperitoneal מסיר המאגף הגבה. השיטה המוצעת זהו leהליך ss פולשני העכבר ממזער נזקים השחלה. כאן אנו מתארים את השלבים מתודולוגיים בפיתוח של היווצרות הגידול המקורי גרורתי של EOC.

Introduction

קרצינומה שחלות אפיתל (EOC) מסבירה את השיעור הגבוה ביותר של תמותה מסרטן בקרב ממאירויות גינקולוגיות ^1. EOC מזוהה עם פרוגנוזה גרועה, בעיקר בשל הסימפטומים שלה מאוחר, והיא קשורה לעיתים קרובות עם disseminations intraperitoneal מרובים גרורות מרוחקות ^2-4. הפצת הצפק היא תהליך רב שלבים. ראשית, תאים סרטניים להתנתק גוש הראשוני, ולהעביר לתוך חלל הבטן. כאשר התאים הסרטניים לצרף mesothelium הצפק, הם מתחילים לפלוש לרקמות דרך ^5,6 mesothelium. על מנת להבין טוב יותר את הביולוגיה של הגידול (למשל, התקדמות סרטן תגובה לטיפול), במודלים של עכברים מספקים שפע של מידע. Xenograft עם תאים סרטניים אנושיים נעשה שימוש נרחב עבור מודלי עכבר שבו תאים סרטניים אנושיים הם מחוסנים תת עורי, intraperitoneally, לתוך וריד, orthotopically. במודל חיה עם g orthotopicallyגידול rafted יכול יותר ביעילות ובדייקנות ליצור לתוצאות המשקפות את סביבת גידול באדם בהשוואה במודל חיה עם גידול מורכב heterotopically. לכן, עבור גידולים אנושיים רבים, מודלי השתלת orthotopic הוקמו ^7-11.

כאן, אנו מתארים את חיסון orthotopic של תאים אנושיים EOC באמצעות גישה retroperitoneal מסירה מאגף הגבי, אשר הגביל הפולשנות לעומת חיסון הגחון. טכניקה זו יכולה לספק מגוון רחב של מידע שימושי על EOC, במיוחד מנגנון הפצת intraperitoneal.

Protocol

פרוטוקול הטיפול פועל בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שאימצה נאגויה האוניברסיטה.

1. הכנת השעיות תא

1. שורת תאים ברורה תא קרצינומה שחלות אדם.
   1. שמור על תאים ES-2 ¹² במדיום RPMI-1640 עם 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין: 100 יחידות / מ"ל, סטרפטומיצין: 0.1 מ"ג / מ"ל). התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO _2.
   2. איסוף תאים בשלב הצמיחה לוגריתמי ב 0.05% טריפסין / 0.02% פתרון EDTA (טריפסין / EDTA).
      1. ראשית, להסיר את המדיה הישנה מספינת תרבית תאים, ואז לשטוף את התאים פעם עם PBS (PBS ללא Ca ^{2 +} / Mg ^2+, 3 - 4 מ"ל לכל 25 ס"מ ^2).
      2. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל לכל 25 ס"מ ² של טריפסין / EDTA. סובב את כלי תרבית תאים כדי לכסות את monolayer תא עם טריפסין / EDTA. לאחר הסרת והשלכת טריפסין / EDTA, להחזיר את התאכלי תרבות כדי בחממה במשך 3 - 5 דקות או עד תאים מנותקים.
      3. בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את התאים מנותקים מפני השטח של כלי תרבית תאים צפים.
      4. להוסיף סרום טרי המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין (5 מ"ל לכל 25 ס"מ ^2), מחדש להשעות את התאים. העבר מחדש מושעה תאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
      5. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. בצע צנטריפוגה או על 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר. מוציאים בזהירות supernatant מחדש להשעות תאים עם מדיום הגידול (5 מ"ל לכל 25 ס"מ ^2).
   3. ספירת תאים (למשל, על ידי הרחקה trypan כחול) ולאחר מכן מחדש להשעות במדיום הגידול בצפיפות של 2 x 10 ⁸ תאים / מ"ל. שים את התאים מושעה על הקרח.
2. מטריקס קפוא להפשיר (ECM) מבוסס aliquots הידרוג'ל באמבט קרח.
3. מוסיף את השעית תא aliquots הידרוג'ל המבוסס ECM ביחס של 1: 1 (ג תא סופיoncentration: 1 x 10 ⁵ תאים / μl של הידרוג'ל בינוני ECM מבוססי) ומערבבים היטב. מניח את מתלי תא המוכנים באמבט קרח עד לשימוש.

2. Orthotopic הרכבה עם השעיות תא

הערה: ניתוח אינו דורש לחבילה ייעודית. הניתוח יכול להתבצע על benchtop מעבדה באזור של החדר כי הוא נפרד ויש לו פעילות מינימלית. מכסה מנוע למינרית גם יכול לשמש. יש להשתמש מכשירי ניתוח סטרילי ומספריים לא אמורים לשמש כדי לעשות חתכים בעור.

1. משתמשים בעכברים עירום נשי (BALB / c נו / נו) אחרי 8 שבועות של גיל עבור דגם חיסון orthotopic זה.
2. ראשית, להרדים את העכבר באמצעות שאיפה עם isoflurane (2 - 4%). בדוק עומק הרדמה על ידי אימות חוסר הנסיגה על קמצוץ בוהן משרד. אחרי העכבר הוא הרדים, להחיל משחה עיניים סטריליות תפל על העיניים כדי למנוע התייבשות כנדרש.
3. מניחים את העכבר הרדים על operating הבמה בצד הבטן כלפי מטה. לחטא את אזור הניתוח מספר פעמים הן עם אלכוהול ו לשפשף יוד המבוססת או כלורהקסידין מבוסס.
4. ביצוע חתך ~ 2 סנטימטר אנכי ליד עמוד השדרה בין לקשת ירך costal התקינה. השתמש לעטוף כירורגית סטרילית סביב אתר החתך. תקן את משטחי עור החרותים עם מהדק כדי לשמור על הפתיחה.
   הערה: Retractors יכול לשמש במקום מלחציים.
5. לאחר מכן, לעשות חתך שני (כ 1 סנטימטר) ב הצפק הקודקודית תחת החתך הראשון כדי לפתוח את חלל הבטן. קלאמפ משטחי בטן החרות. קליפ רקמת השומן המקיף את צינור השחלה השחלה ipsilateral עם מלחציים להסיר את השחלה מחלל הבטן. בזהירות את השחלה החצוצרה על גזה. לאחר מכן, הצב את העכבר בצד הבטן כלפי מטה תחת מיקרוסקופ לנתח.
6. מניחים את ההשעיה תא מזרק אינסולין (1/2 סמ"ק, 29 G) ממש לפני ההזרקה. בזהירות להזריק את השעית התא המוכנה (1- 2 μl) לתוך השחלה. במשך כמה שניות, לשמור את המחט בתוך השחלה כדי להבטיח gelation של הידרוג'ל מבוסס ECM. לאחר gelation, תאי הגידול המוזרקים להישאר בתוך השחלה.
7. בזהירות להחזיר את השחלה אל תוך הגוף. לתפור את החתך השני עם משי רפואי סטרילי, ואז לאטום את העור עם קליפים הפצע.
8. לאחר ניתוח, העכברים ינוהלו שיכוך כאבים (למשל, meloxicam, תוך שרירית (IM) או תת עורית (SC), 0.2 מ"ג / קילו) לתקופת 24 שעות ראשוניות.

טיפול 3. לאחר ניתוח

1. מניח כל עכבר בכלוב נפרד על נייר נקי עם חבילה חמימה כדי לשמור על חומו העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. לאחר מכן, להחזיר את החיות בכלובים שלהם לגידול וניטור. לפקח על עכברים כל יום במשך 3 - 7 ימים לאחר טיפול כירורגי.
2. ניטור של עכברים לאחר ניתוח
   1. במקרה של סימנים של כאב, לנהל analgeSICS יומי (למשל, meloxicam, im או SC, 0.2 מ"ג / ק"ג).
   2. אם יש עכברים סימני זיהום (למשל, אדמומיות, נפיחות, הפרשות), לנהל זריקה יומית עם מגיב אנטי זיהומיות (למשל, פניצילין, im, 100,000 IU / ק"ג).
3. סר חומר סגירת עור 10 - 14 ימים לאחר טיפול לאחר ניתוח.

ניתוח 4. של גידולים וגרורות

הערה: הגידול יוקם בבית 2 מוזרק השחלה - 3 השבועות לאחר חיסון.

1. להקריב את העכברים על ידי פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לאסוף דגימות (למשל, גידולים, גרורות, איברים) ^13-15 לניתוח נוסף ^14,16-20.
   הערה: אם מערכת הדמית in vivo זמינה, תאי נושאות אנזימים המייצרים פליטת אור (למשל, בלוציפראז) או חלבון פלואורסצנטי (למשל, ה- GFP) ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. פרוטוקול שונה זה יספק מידע שימושיהדינמיקה של התפשטות תאים סרטניים מהגידול הראשוני.

תוצאות

שישה עכברים בעירום חסנו השחלות שלהם עם תאי תאי קרצינומה הקו ברור הגזע עוברי-2, כמתואר בפרוטוקול זה. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', לאחר 2 שבועות, 5 מתוך 6 העכברים היה גידול בשחלה מחוסן עם ES-2 תאים, אבל לא היה גידול בשחלה הנגדי ללא חיסון (ששימשו...

Discussion

במודלים של בעלי חיים חיוניים כדי לנתח את מנגנוני התפתחות גידולים, התקדמות, גרורות, וכן יעילות התרופה כנגד תאים סרטניים. בעכברים נושאי בתאי סרטן שחלות אדם גם שמשו במודל חיה. כאן אנו מתארים הליך פולשני פחות עבור הממשל של תאים סרטניים בשחלות ב אתר orthotopic. באמצעות הליך זה, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel matrix	BD	354234	ECM-based hydrogel
Insulin syringe	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture			11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip Applier	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm wound clips	CellPoint Scientific	203-1000