Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Abstract

مسببات وآثار تعرض الإنسان لمسببات الأمراض البيئية يشكل مصدر قلق كبير في جميع أنحاء العالم، وهكذا، فإن القدرة على تقييم فعالية النهج الإنتاجية العالية التعرض والالتهابات باستخدام التكلفة ستكون لا غنى عنه. توضح هذه المخطوطة تطوير وتحليل المناعه تعدد الإرسال القائم على حبة قادرة على قياس وجود الأجسام المضادة في لعاب الإنسان لمسببات الأمراض متعددة في وقت واحد. اللعاب هو جاذبية خاصة في هذا الطلب لأنه موسع، أرخص وأسهل لجمع من المصل. اقترنت مستضدات من مسببات الأمراض البيئية المجهرية carboxylated (الخرز) وتستخدم لقياس الأجسام المضادة في كميات صغيرة جدا من عينات لعاب الإنسان استخدام، حل مرحلة الفحص القائمة على حبة. وإلى جانب الخرز مع مستضدات من العطيفة الصائمية، هيليكوباكتر بيلوري، التوكسوبلازما، noroviruses (G I.1 وG II.4) والتهاب الكبد الوبائي أ. لضمان أن المستضدات واقترنت بما فيه الكفاية لالخرز، تم تأكيد اقتران باستخدام أنواع محددة، والأجسام المضادة القبض الأساسي المشتقة من الحيوانات، تليها الحضانة مع المعقدة البيروكسيديز مكافحة أنواع الأجسام المضادة كشف الثانوية ومراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE). كوسيلة لمراقبة لقياس غير محددة وملزمة، كان يعالج مجموعة واحدة حبة مطابق للآخرين إلا لم تترافق إلى أي مستضد. وثم حضنت الخرز جانب مستضد والسيطرة مع عينات من اللعاب البشري التي جمعت بأثر رجعي، تقاس على محلل عالية الإنتاجية على أساس مبادئ التدفق الخلوي، وقياس وجود الأجسام المضادة للكل مستضد في وحدات كثافة الوسيط الإسفار (MFI) . هذا المناعية تعدد الإرسال لديها عدد من المزايا، بما في ذلك المزيد من البيانات مع أقل عينة. خفض التكاليف والعمل؛ والقدرة على تخصيص فحص للعديد من الأهداف المثيرة للاهتمام. وتشير النتائج إلى أن المناعية تعدد الإرسال اللعاب قد تكون قادرة على تحديد التعرض والالتهابات السابقة، التي يمكن أن تكون especiaمفيد LLY في دراسات المراقبة التي تنطوي على البشر كبير.

Introduction

ثمانية وثمانين في المئة من الأمراض المرتبطة بالإسهال في جميع أنحاء العالم ويرتبط مع التعرض البشري للمياه الملوثة، الأغذية غير المأمونة، وسوء الصرف الصحي / النظافة، مما تسبب في ما يقرب من 1.5 مليون حالة وفاة، وغالبيتهم من الأطفال 1. وهذا هو السبب الرئيسي للقلق لمسؤولي الصحة العامة وصانعي السياسات. في محاولة لتقصي حالات التعرض والأمراض المرتبطة المنقولة عن طريق المياه ومسببات الأمراض البيئية الأخرى، وضعنا المناعية تعدد الإرسال لقياس الأجسام المضادة في العينات البشرية 2-4. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لدراسات وبائية لتحديد تعرض الإنسان لهذه الجراثيم، وتحديد أفضل التهابات immunoprevalence وقوع الحادث.

اللعاب يبشر بالخير الكبير كبديل للمصل للأبحاث العلامات البيولوجية البشرية. ومن بين مزايا استخدام اللعاب هي غير الغازية وسهولة جمع العينات، وانخفاض التكلفة، ويمكن بسهولة أن تجمع عينات من الأطفال 5-7 </ سوب>. وقد تم دراسة عينات من مصل الدم واللعاب على نطاق واسع عن الأجسام المضادة ضد ه. بيلوري 2،3،8، المتصورة المنجلية 9، المتحولة الحالة للنسج 10، كريبتوسبوريديم بارفم 3،11، العقدية الالتهاب الرئوي 12 وفيروسات التهاب الكبد A و C 13-14، noroviruses 2-4،15، T. التوكسوبلازما 2-4 وحمى الضنك فيروس 16، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) 17، والإشريكية القولونية O157: H7 18.

والمناعية تعدد الإرسال يسمح لتحليل التحاليل متعددة في وقت واحد داخل حجم العينة واحد وخلال دورة واحدة أو التشغيل. مستضدات المضاعفة من C. الصائمية، T. التوكسوبلازما، H. pylori واستخدمت التهاب الكبد الوبائي أ، واثنين من noroviruses لقياس البشري اللعاب مفتش 2-4 وايغا 3،4 والبلازما مفتش 2،3 استجابات الأجسام المضادة لهذه الجراثيم باستخدامالقائم على حبة المناعية الإرسال المتعدد. عندما تستخدم بالاقتران مع الدراسات الوبائية من التعرض للميكروبات في الماء والتربة والغذاء، ونوع من الفحص وصفها في هذه الدراسة قد توفر معلومات قيمة لتعزيز فهم الالتهابات التي تسببها الجراثيم البيئية. وعلاوة على ذلك، البيانات الأجسام المضادة اللعابية تم الحصول عليها من هذه الدراسات يمكن استخدامها لتحسين نماذج تقييم المخاطر 19-22.

Protocol

تم الحصول على موافقة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB # 08-1844، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمع عينات من اللعاب فلعية حفز من مرتادي الشواطئ في بوكيرون بيتش، وبورتوريكو، وذلك كجزء من الولايات المتحدة وكالة حماية البيئة (وكالة حماية البيئة) الوطني للوبائيات والتقييم البيئي للالترفيهية (NEEAR) دراسة المياه 23 لتقييم السباحة يرتبط التعرض والأمراض. موضوعات الدراسة توفر الموافقة المسبقة وصدرت تعليمات حول استخدام الجهاز جمع اللعاب من قبل المقاولين وكالة حماية البيئة المدربين. تم شحن عينات من اللعاب على الجليد، وعند استلام، كانوا طرد وتخزينها في -80 درجة مئوية كما هو موضح 4.

1. تفعيل الخرزة

  1. و resuspend أسهم مجموعة حبة من قبل vortexing وsonicating لمدة 20 ثانية، ونقل ما يقرب من 5.0 × 10 6 حبات الأوراق المالية (400 ميكرولتر) لأنابيب microcentrifuge.
    ملاحظة: Tانه الخرز يتم توفيره بتركيز 12.5 × 10 6 حبات / مل.
  2. بيليه حبات الأسهم عن طريق الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  3. إزالة طاف و resuspend حبات مكعبات في 100 ميكرولتر الماء المقطر (DH 2 O) من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية. كرر الخطوة 1.2.
  4. إزالة طاف و resuspend حبات غسلها في 80 ميكرولتر من 100 مم أحادي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.2 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  5. مباشرة قبل الاستعمال، وجعل حل 50 ملغ / مل N -hydroxysulfosuccinimide (سلفو NHS) وذلك بإضافة 200 ميكرولتر درهم 2 O إلى 10 ملغ سلفو NHS قسامة. مزيج من قبل دوامة.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من 50 ملغ / مل سلفو NHS إلى الخرز. مزيج من قبل دوامة.
  7. مباشرة قبل الاستعمال، وجعل 50 ملغ / مل 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) الحل بإضافة 200 ميكرولتر الماء المقطر (DH 2 O) إلى EDC قسامة 10 ملغ. مزيج من قبل دوامة.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من 50حل ملغ / مل EDC إلى الخرز. مزيج من قبل دوامة. احتضان حبات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام، مع خلط من قبل دوامة في 10 دقيقة فترات. بيليه الخرز تفعيلها من خلال microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  9. إزالة طاف و resuspend الخرز في 250 ميكرولتر من 50 ملي 2- [N -Morpholino] حامض ethanesulfonic (MES)، ودرجة الحموضة 5.0 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  10. بيليه الخرز تفعيلها من خلال microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  11. كرر الخطوات من 1.9 و 1.10.
    ملاحظة: هذا يوفر ما مجموعه اثنين من يغسل مع 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0.
  12. resuspend والخرز في 100 ميكرولتر من 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0 من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.

2. حبة اقتران

  1. زوجان المستضدات إلى مجموعات حبة باستخدام تركيزات هو مبين في الجدول رقم 1.
  2. إضافة كل مستضد إلى الخرز تنشيط وجلب الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر في 50 ملي زارة التربية والعلم، ودرجة الحموضة 5.0. مزيج من المضادات لحبات يوميا بحلول دوامة.
  3. احتضان المستضدات والخرز لمدة 2 ساعة مع خلط بالتناوب (~ 15 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بيليه حبات مقرونا microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  4. إزالة طاف و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ألبومين المصل -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (توين-20) -sodium أزيد (PBS-TBN) ودرجة الحموضة 7.4 من دوامة وصوتنة. بيليه الخرز التي microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف.
    تحذير: أزيد الصوديوم هو مادة كيميائية سامة بحدة. وهو خطير إذا ابتلع أو يحصل على اتصال مع الجلد. لا تتنفس الغبار / الدخان / الغاز / الضباب / الأبخرة أو الرش. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE ل) عند التعامل مع والتخلص منها طبقا للقوانين المناسبة.
  5. resuspend والخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتعمل المنظمة من قبل دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  6. بيليه الخرز التي microcentrifugation في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  7. كرر الخطوات من 2.5 و 2.6.
    ملاحظة: هذا يوفر ما مجموعه اثنين من يغسل مع برنامج تلفزيوني TBN.
  8. resuspend والخرز جانب وغسلها في 1 مل من برنامج تلفزيوني، 1٪ BSA، 0.05٪ أزيد، ودرجة الحموضة 7.4. تخزين حبات جانب في C الثلاجة 2-8 درجة في الظلام.

3. عدد الخرزة

  1. إعداد 1:10 التخفيف من الخرز يقترن في الماء أو العازلة في برنامج تلفزيوني.
  2. تحميل 10 ميكرولتر من التخفيف خرزة على عدادة الكريات عند نقطة العينة المقدمة.
  3. عد حبات ينظر في واحدة من 4 × 4 شبكات الزاوية. حساب عدد من الخرز يقترن باستخدام المعادلة التالية: عدد (1 ركن من 4 × 4 الشبكة) س (1 × 10 4) س (عامل تمييع) س إعادة تعليق حجم في مل.

4. التأكيد من Antigen اقتران

  1. resuspend ومزيج الأوراق المالية من الخرز بالإضافة إلى مولدات المضادات من الاهتمام من قبل دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  2. تحضير خليط حبة تعمل عن طريق تمييع الأسهم حبة بالإضافة إلى المباراة النهائيةتركيز 100 الخرز / ميكرولتر من كل حبة فريدة المنصوص عليها في برنامج تلفزيوني-1٪ عازلة BSA (PBS-1٪ BSA، ودرجة الحموضة 7.4).
  3. إعداد لا يقل عن 7 شقين التخفيفات المسلسل مكافحة الأنواع مفتش الأجسام المضادة الأولية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة في 96-جيدا لوحة أسفل مستديرة مع العازلة في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  4. قبل الرطب عمود 8 جيدا منفصل (8 صفوف) من أسفل لوحة تصفية 96-جيدا لكل مستضد اختبار تأكيد اقتران مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. إضافة 50 ميكرولتر من العمل خليط حبة (الخرز يقترن مستضد) إلى الآبار قبل الرطب.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من التخفيفات الأجسام المضادة للصفوف 1-7 من كل عمود من مرشح لوحة 96-جيدا و50 ميكرولتر من العازلة BSA PBS-1٪ إلى صف 8 بدلا من الأجسام المضادة المخفف لتكون بمثابة آبار الخلفية. الاختلاط مع pipettor متعددة القنوات من pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات. تنفيذ نفس الإجراء كل مجموعة حبة جانب مستضد إلى تأكيد.
  6. تغطية والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفةerature لمدة 1 ساعة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية 500 دورة في الدقيقة. إزالة طاف بواسطة فراغ.
  7. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. كرر 1X. resuspend والخرز في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  8. تمييع المعقدة البيروكسيديز المضادة للأنواع محددة مفتش الأضداد كشف الثانوي إلى 16 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى كل بئر بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات.
  10. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  11. resuspend والخرز في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  12. تمييع مراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE) إلى 24 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  13. إضافة 50 ميكرولتر من مراسل إلى كل بئر وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات.
  14. Cعلى لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  15. الخرز resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA وتحليل 50 ميكرولتر باستخدام محلل 29.
    ملاحظة: يتم قياس نتائج المناعية تعدد الإرسال القائم على حبة في شدة الإسفار وسيطة (MFI). دائما الرجوع إلى أحدث إصدار من دليل البرنامج، إذا كان متوفرا لتجنب الأخطاء.

5. اللعابية المتعددة المناعية

  1. إزالة اللعاب من الفريزر -80 درجة مئوية، والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
  2. و resuspend مستضد يقترن الأسهم حبة من دوامة وصوتنة لمدة 20 ثانية.
  3. تحضير خليط حبة تعمل عن طريق تمييع الأسهم حبة بالإضافة إلى التركيز النهائي من 100 الخرز / ميكرولتر من كل مجموعة حبة فريدة من نوعها في برنامج تلفزيوني-1 عازلة٪ BSA.
  4. إعداد التخفيف 1: 4 من اللعاب ثإيث PBS-1 العازلة BSA٪ في 96 جيدا، عميقة لوحة جيدا.
  5. قبل الرطب لوحة تصفية مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من خليط حبة العمل وحجم مساو من اللعاب المخفف إلى 95 بئرا من 96 لوحات مرشح جيدا ل1: 8 التخفيف النهائي. مزيج ردود الفعل مع pipettor متعدد القنوات. إلى عنصر تحكم واحد أيضا، إضافة 50 حبات يقترن مستضد ميكرولتر بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1 عازلة٪ BSA (كبديل لعاب).
  7. تغطية والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية 500 دورة في الدقيقة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  8. حبات Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  9. تمييع الماعز المعقدة البيروكسيديز مفتش مكافحة الإنسان الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية إلى 16 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  10. إضافة 50 ميكرولتر المخفف الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر وتخلط محتويات معوpipettor متعدد القنوات.
  11. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  12. حبات Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA مع pipettor متعدد القنوات.
  13. تمييع مراسل streptavidin-R-فيكوإيريترين (SAPE) إلى 24 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-1٪ BSA.
  14. إضافة المراسل 50 ميكرولتر إلى كل بئر وتخلط مع pipettor متعدد القنوات.
  15. تغطية لوحة مرشح والسماح لاحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة. إزالة طاف بواسطة فراغ. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة وإزالة طاف بواسطة فراغ. تكرار غسل 1X.
  16. الخرز resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-1٪ BSA وتحليل 50 ميكرولتر باستخدام محلل 29.
    يتم قياس نتائج المناعية تعدد الإرسال في وحدات الوسيط الإسفار كثافة (MFI): مذكرة. دائما الرجوع إلىأحدث نسخة من دليل البرنامج، إذا كان متوفرا لتجنب الأخطاء.

النتائج

تم استخدام مجموعة واحدة حبة فريد كوسيلة لمراقبة لقياس غير محددة وملزمة وعينة لعينة التباين. تم علاج هذه الخرز بشكل مطابق للمستضد إلى جانب حبات باستثناء أنهم لا حضنت مع أي مستضد في خطوة اقتران. تم إزالة القيم المؤسسة> 500 تم الحصول عليها من الخرز السي...

Discussion

وتشير هذه النتائج إلى أن الطريقة المناعية تعدد الإرسال مفيد للتمييز بين عينات اللعاب التي immunopositive أو immunonegative. لتحديد مناعة، وضعت النقطة الفاصلة واحدة عن طريق حساب متوسط ​​زائد ثلاثة انحرافات معيارية من سجل حولت الردود مؤسسات التمويل الأصغر من الخرز وفكت السيطرة ا?...

Disclosures

الوكالة الأمريكية لحماية البيئة من خلال مكتبها للبحوث والتنمية بتمويل وإدارة البحوث هو موضح هنا. وقد خضع للمراجعة الإدارية الوكالة وافقت للنشر. لا تشكل ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية تأييد أو توصية للاستخدام.

Acknowledgements

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Software
MicrocentrifugeThermo Electron Corporation75002446Used to centrifuge samples
Vortex MixerVWRG560Used to mix samples
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.CappVarious
Hemacytometer (Bright Line)Housser Scientific 3200Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum ManifoldMilliporeMSVMHTS00Used in washing steps to remove supernatant
MicroShakerVWR12620-926Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)VWR30128-346
Weighing ScaleMettler or otherUsed to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUsed to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 softwareLuminex CorporationLX200-XPON3.1Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell cultureMeridian Life Sciences8505Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysateMeridian Life SciencesR14101Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cellsKPL50-92-93Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus(CCHMC)*NAUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pyloriKPL01-93-94Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter speciesKPL01-92-93Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)KPL16-13-06Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)KPL16-18-06Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)KPL176-1506Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) KPL16-10-02Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubesUSA Scientific1415-2500Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refillsBioVentures5030050C
200 µL pipette tip refillsBioVentures5030080C
1000 µL pipette tip refillsBioVentures5130140C
Aluminum foilVarious VendorsUsed keep beads in the dark during incubations
Deep Well platesVWR40002-009Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter PlatesMilliporeMABVN1250Used to run assays
Oracol saliva collection systemMalvern Medical Developments LimitedUsed for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)Luminex CorporationDependent on bead setAntigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)Pierce77149 or 22980Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce24510Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)Molecular ProbesS-866Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaM-2933Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)SigmaP-9416Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSASigmaA-78880.1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**SigmaS-8032**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)SigmaS-31390.1M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 carboxylated

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved