Разработка слюнных антитела Multiplex иммуноанализа для измерения воздействия на человека окружающей среды патогенам

Резюме

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Аннотация

Этиология и последствия воздействия на человека экологических патогенов вызывают серьезную озабоченность во всем мире и, таким образом, способность оценивать воздействие и инфекции с использованием экономически эффективных, с высокой пропускной способностью подходов было бы обойтись. Эта рукопись описывает развитие и анализ бисерной на основе мультиплексной иммунологического анализа, способного измерять наличие антител в слюне человека к нескольким патогенам одновременно. Слюна является особенно привлекательным в этом приложении, поскольку она является неинвазивным, дешевле и легче собирать, чем сыворотки. Антигены окружающей среды патогенных микроорганизмов были соединены с карбоксилированные микросферы (бусинок) и используется для измерения антител в очень малых объемах образцов слюны человека, используя бусинки на основе раствора фазы анализа. Гранулы в сочетании с антигенами из Campylobacter jejuni, Helicobacter Pylori, токсоплазма, норовирусами (G I.1 и G II.4) и Вирус гепатита А. Для того, чтобы гарантировать, что антигены были в достаточной степени соединены сгранулы, муфта была подтверждена с использованием видоспецифические, животного происхождения антитела первичного захвата, с последующей инкубацией с биотинилированным анти-видовых вторичными антителами обнаружения и стрептавидин-R-фикоэритрин репортер (SAPE). В качестве контроля для измерения неспецифического связывания, один набор шарик обрабатывали идентично другим за исключением того, что не был связан с какой-либо антигена. Антиген связью и контрольные шарики затем инкубировали с перспективно-собранных образцах слюны человека, измеренный на анализаторе с высокой пропускной способностью на основе принципов проточной цитометрии, а наличие антител к каждому антигену измеряли интенсивность единицах Медиана флюоресценции (MFI) , Этот мультиплекс иммунологический имеет ряд преимуществ, в том числе больше данных с меньшим количеством образца; снижение затрат и труда; и возможность настройки анализа для многих целей, представляющих интерес. Результаты показывают, что слюнной мультиплексного иммуноанализа может быть способен идентифицировать предыдущих воздействий и инфекций, которые могут быть EspeciaLLY полезным при изучении наблюдения с участием крупных человеческих популяций.

Введение

Восемьдесят восемь процентов диареи , связанных с болезнью во всем мире связаны с воздействием на человека загрязненной воды, небезопасных пищевых продуктов и плохой санитарии / гигиены, в результате чего около 1,5 миллиона случаев смерти, большинство из которых являются дети ^1. Это является основной причиной беспокойства для должностных лиц общественного здравоохранения и лиц, определяющих политику. В целях изучения воздействия и болезней , связанных с водорастворимыми и другими экологическими патогенами, мы разработали мультиплекс иммуноферментного анализа для измерения антител в образцах человеческих тканей ^2-4. Этот метод может быть применен к эпидемиологических исследований для определения воздействия на человека этих патогенов и для более четкого определения immunoprevalence и инцидентов инфекции.

Слюна имеет значительные перспективы в качестве альтернативы сыворотки для исследования биомаркеров человека. Среди преимуществ использования слюну являются не-инвазивности и легкость сбора проб, низкая стоимость, и образцы могут быть легко собраны из детей ^{5-7 <}/ SUP>. Образцы сыворотки и образцы слюны были изучены на наличие антител против H. пилори ^2,3,8, малярийного плазмодия ^9, дизентерийная амёба ^10, Cryptosporidium parvum ^3,11, Streptococcus пневмонии ^12, вирусов гепатита А и С ^13-14, Noroviruses ^2-4,15, Т. гондий ^2-4, вирус лихорадки денге ^16, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) , ^17, и кишечная палочка О157: Н7 ^18.

Многозальный иммунологический позволяет для анализа нескольких аналитов одновременно в пределах одного объема образца и в пределах одного цикла или бега. Мультиплексные антигены из C. jejuni, Т. гондий, H. Pylori, вирус гепатита А, и два Noroviruses были использованы для измерения человеческого IgG в слюне ^2-4 и IgA ^3,4 и плазмы IgG ^2,3 ответ антител на этих патогенов с использованиембусинка мультиплексирование на базе иммунологического анализа. При использовании в сочетании с эпидемиологических исследований воздействия микробов в воде, почве и пищевых продуктов, тип анализа, описанного в данном исследовании, может дать ценную информацию для улучшения понимания инфекций, вызванных экологическими патогенами. Кроме того, слюнные данные , полученные из антител таких исследований могут быть использованы для улучшения моделей оценки риска ^19-22.

протокол

Утверждение было получено из Совета по институциональному (IRB # 08-1844, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США) для сбора стимулированных десневой борозды образцов слюны из пляжников в Boqueron Beach, Пуэрто-Рико, как часть Соединенных Штатов Агентство по охране окружающей среды (USEPA) Национальная эпидемиологическая и экологическая оценка рекреационной (NEEAR) Вода исследования ²³ для оценки плавания связаны воздействия и болезней. Испытуемых при условии, информированное согласие и было дано указание об использовании устройства сбора слюны обученными подрядчиками USEPA. Образцы слюны были отправлены на льду и, после получения, их центрифугировали и хранили при температуре -80 ° С , как описано ^4.

1. Шарик активации

1. Ресуспендируют шарик набор акций путем встряхивания и обрабатывали ультразвуком в течение 20 сек и передачи приблизительно 5,0 × 10 ⁶ фондовых шариков (400 мкл) в микропробирок.
   Примечание: Tон бисер поставляются в концентрации 12,5 х 10 ⁶ бусин / мл.
2. Гранул акции шарики центрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
3. Удалить супернатант и ресуспендируют Осажденный бусин в 100 мкл дистиллированной воды (дН ₂ O) с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек. Повторите шаг 1.2.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют промытых бусин в 80 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия, рН 6,2 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
5. Непосредственно перед использованием, чтобы раствор 50 мг / мл N -hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) путем добавления 200 мкл дН ₂ O до 10 мг сульфо-NHS ​​аликвоты. Смешать вихря.
6. Добавляют 10 мкл 50 мг / мл сульфо-NHS ​​к шарикам. Смешать вихря.
7. Непосредственно перед использованием, чтобы 50 мг / мл 1-этил- [3 - диметиламинопропил] карбодиимида раствор (ДХЭ) путем добавления 200 мкл дистиллированной воды (дН ₂ O) с 10 мг EDC аликвоты. Смешать вихря.
8. Добавляют 10 мкл 50мг / мл EDC раствора к шарикам. Смешать вихря. Выдержите шариками в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте, при перемешивании с помощью вихря с интервалом 10 мин. Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
9. Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 250 мкл 50 мМ 2- [N -Morpholino] этансульфоновой кислоты (MES), рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
10. Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
11. Повторите шаги 1.9 и 1.10.
    Примечание: Это обеспечивает в общей сложности двух промывок с помощью 50 мМ MES, рН 5,0.
12. Ресуспендируют бисером в 100 мкл 50 мМ MES, рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.

2. Сцепление из бисера

1. Пара антигены к наборам бусинки с использованием показанных в таблице 1.
2. Добавьте каждый антиген к активированным бусинок и довести общий объем до 500 мкл в 50 мМ MES, рН 5,0. Смешать антигеныг бисера вихря.
3. Выдержите антигены и бусинки в течение 2 ч при перемешивании вращением (~ 15 оборотов в минуту) при комнатной температуре в темноте. Гранул соединенные шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), -bovine сывороточного альбумина (БСА) -polyoxyethylenesorbitan монолаурат (Tween-20) -натрий азид (ПБС-ТБН) рН 7,4 с помощью вихря и обработки ультразвуком. Гранул бусинки микроцентрифугированием при 10000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант.
   Внимание: азид натрия является остро токсичным химическим веществом. Это приводит к летальному исходу при проглатывании или вступает в контакт с кожей. Не вдыхать пыль / дыма / газа / тумана / паров или аэрозолей. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), когда транспортная обработка и утилизировать в соответствии с соответствующими законами.
5. Ресуспендируют бисером в 1 мл PBS-ТБН от вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
6. Гранул шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
7. Повторите шаги 2.5 и 2.6.
   Примечание: Это обеспечивает в общей сложности два промывок PBS-ТБН.
8. Ресуспендируют спаренной и промытые бусин в 1 мл PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида, рН 7,4. Храните спаренных бусин в 2-8 ° C холодильнике в темноте.

3. Шарик граф

1. Приготовьте разведение 1:10 спаренных бусин в воде или буфере PBS.
2. Нагрузка 10 мкл кромочной разбавлении на гемоцитометра в точке ввода образца.
3. Граф бусинки видели в одном из 4-х 4 угловых сеток. Подсчитайте общее количество связанных шариков , используя следующую формулу: Count (1 угол 4 х 4 сетки) х (1 х 10 ⁴⁾ х (коэффициент разбавления) х ресуспендирования объем в мл.

4. Подтверждение Antigen Муфта

1. Ресуспендируют запаса смеси шариков, соединенных с антигенами интерес вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
2. Подготовить рабочую смесь шарик путем разбавления спаренной запасов шарик до конечнойконцентрации 100 бусин / мкл каждого уникального шарика, установленного в PBS-1% BSA буфера (PBS-1% BSA, рН 7,4).
3. Приготовьте по крайней мере, 7 двукратные серийные разведения анти-IgG видов первичного антитела в соответствии с рекомендациями производителя в 96-луночных круглодонных пластины с PBS-1% BSA буфера.
4. Предварительное смачивание отдельный столбец 8-а (8 строк) 96-луночного фильтра нижней пластины для каждого испытания подтверждения сцепка антигена с помощью 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Добавьте 50 мкл рабочего шарика смеси (антиген-гранулы) в сочетании с предварительно водосборных колодцах.
5. Добавляют 50 мкл разведений антител к строкам 1-7 каждого столбца фильтра 96-луночного планшета и 50 мкл PBS-1% BSA буфера к Ряд 8 вместо разведенного антитела , чтобы служить в качестве фоновых скважин. Смешать с многоканальным дозаторов с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз. Выполните ту же процедуру для каждого антигена в сочетании набора борта должны быть подтверждены.
6. Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температурературе в течение 1 ч на микропланшет-шейкере при 500 оборотах в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума.
7. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторить 1 раз. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
8. Развести биотинилированного антитела против IgG к другому виду специфический вторичного антитела обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
9. Добавляют 50 мкл разведенной вторичного антитела в каждую лунку с помощью пипетки вверх и вниз в 5 раз.
10. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
11. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
12. Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
13. Добавьте 50 мкл репортера в каждую лунку и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз.
14. Снад фильтровальной пластине и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
15. Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора ^29.
    Примечание: Результаты борта на основе мультиплексного иммуноанализа измеряются в Срединной интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти в последней версии программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.

5. слюнных Multiplex иммуноферментный

1. Удалить слюну от -80 ° C морозильника и позволяют оттаивают при комнатной температуре.
2. Ресуспендируют антиген в сочетании запасов бусинки вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
3. Подготовьте рабочую шарик смеси путем разбавления спаренной запасов шарик до конечной концентрации 100 бусин / мкл каждого уникального набора шарик в PBS-1% BSA буфера.
4. Подготовьте 1: 4 разведение слюны шIth PBS-1% BSA буфера в 96-луночный, глубокий луночный планшет.
5. Предварительно влажной фильтровальной пластины с 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума.
6. Добавляют 50 мкл рабочей смеси и бисерной равным объемом разбавленной слюны до 95 лунок 96-луночных фильтровальных пластин для 1: окончательного разведения, 8. Смешайте реакции с многоканальным дозаторов с. К одной контрольной лунки, добавляют 50 мкл с иммобилизованным антигеном бусин плюс 50 мкл PBS-1% BSA буфера (в качестве замены для слюне).
7. Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч на микропланшет-шейкере со скоростью 500 оборотов в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
8. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
9. Развести биотинилированным козьим IgG против человеческого антитела вторичного обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
10. Добавляют 50 мкл разведенного вторичного антитела в каждую лунку и перемешать содержимое сМногоканальная пипетки а.
11. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
12. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
13. Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
14. Добавляют 50 мкл репортера в каждую лунку и смешайте с многоканальным дозаторов с.
15. Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
16. Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора ^29.
    Примечание: Результаты мультиплексного иммуноанализа измеряются в Медиана единицах интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти впоследняя версия программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.

Результаты

Один уникальный набор шарик был использован в качестве контроля для измерения неспецифического связывания и образца к образцу изменчивости. Эти шарики обрабатывали идентично с антигеном в сочетании бусинок, за исключением, что они не были инкубированы с любым антиг?...

Обсуждение

Эти результаты указывают на то, что мультиплекс метод иммуноанализа полезен для различения между образцами слюны, которые иммунопозитивные или immunonegative. Для определения иммунопозитивность, одна точка отсечения была разработана путем вычисления среднего значения плюс три стандартных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Used to centrifuge samples
Vortex Mixer	VWR	G560	Used to mix samples
Sonicator (mini)	Fisher Scientific	15-337-22	Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	Various
Hemacytometer (Bright Line)	Housser Scientific	3200	Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold	Millipore	MSVMHTS00	Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker	VWR	12620-926	Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)	VWR	30128-346
Weighing Scale	Mettler or other		Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer	Invitrogen	947-01	Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software	Luminex Corporation	LX200-XPON3.1	Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture	Meridian Life Sciences	8505	Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate	Meridian Life Sciences	R14101	Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)	Meridian Life Sciences	R18426	Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells	KPL	50-92-93	Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus	(CCHMC)*	NA	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species	KPL	01-92-93	Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	KPL	176-1506	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)	KPL	16-10-02	Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills	BioVentures	5030050C
200 µL pipette tip refills	BioVentures	5030080C
1000 µL pipette tip refills	BioVentures	5130140C
Aluminum foil	Various Vendors		Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates	VWR	40002-009	Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates	Millipore	MABVN1250	Used to run assays
Oracol saliva collection system	Malvern Medical Developments Limited		Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)	Luminex Corporation	Dependent on bead set	Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	Pierce	77149 or 22980	Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Pierce	24510	Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)	Molecular Probes	S-866	Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	M-2933	Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	Sigma	P-9416	Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	Sigma	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**	Sigma	S-8032	**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)	Sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	Sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN