環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

要約

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

要約

病因および環境病原体に対するヒトの曝露の影響世界中の主要な関心事であると、このように、効果的なコストを用いて露光し、感染を評価する能力、高スループットのアプローチが不可欠であろう。この原稿は、同時に複数の病原体に対するヒトの唾液中の抗体の存在を測定することができるビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの開発と分析を記載します。血清より収集するために、非侵襲的に安価かつ容易であるため、唾液は、この用途に特に魅力的です。環境病原体からの抗原は、カルボキシル化ミクロスフェア（ビーズ）に結合され、ビーズに基づく、溶液相アッセイを用いたヒトの唾液サンプルの非常に少量で、抗体を測定するために使用しました。ビーズはカンピロバクター、ヘリコバクター・ピロリ菌、トキソプラズマ、ノロウイルス（G I.1およびG II.4）およびA型肝炎ウイルス由来の抗原と結合させました。抗原が十分に結合させたことを確認するために、ビーズは、結合は、ビオチン化抗種二次検出抗体およびストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）とのインキュベーション、続いて、種特異的な、動物由来の一次捕捉抗体を用いて確認しました。非特異的結合を測定するための対照として、あるビーズセットは、それが任意の抗原に結合しなかった以外、他に同様に処理しました。抗原結合およびコントロールビーズは、次いで、フローサイトメトリーの原理に基づいて、ハイスループット分析器で測定し、プロスペクティブ・採取したヒト唾液試料と共にインキュベートし、そして各抗原に対する抗体の存在は、蛍光強度中央値の単位（MFI）を測定しました。 。このマルチプレックスイムノアッセイは少ないサンプルでより多くのデータを含む多くの利点を、持っています。コスト削減と労働;関心のある多くのターゲットにアッセイをカスタマイズする機能。結果は、唾液、マルチプレックスイムノアッセイをespeciaあり得る、以前の曝露および感染を識別することが可能であることを示しています大規模な人間の集団を含むサーベイランス研究でLLY有用。

概要

下痢関連の病気の85八パーセントは、全世界で約150万人の死亡を引き起こし、汚染された水へのヒトの暴露、危険な食品、および不衛生/衛生状態に関連付けられている、の大半は子供^1です 。これは、公衆衛生当局や政策立案者のための懸念の主な原因です。水性およびその他の環境の病原体に関連したエクスポージャーや病気を調査するための努力で、我々は、ヒト試料^2-4中の抗体を測定するためのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。この方法は、これらの病原体へのヒトの暴露を決定するために、より良いimmunoprevalence入射感染を定義するために疫学的研究に適用することができます。

唾液は、人間のバイオマーカー研究のための血清の代替としてかなりの可能性を秘めています。唾液を使用する利点の中でも、サンプル収集、低コストの非侵襲性と使いやすさであり、試料を容易に^<子供^5-7から収集することができます/ SUP>。血清および唾液サンプルは、Hに対する抗体のために広く研究されてきましたピロリ ^2,3,8、 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium ^{falciparum）9、} 赤痢アメーバ ^10、クリプトスポリジウム ^3,11、 肺炎連鎖球菌 ^12、肝炎ウイルスAとC ^13-14、 ノロウイルス ^2-4,15、T.ゴンジ ^2-4、デング熱ウイルス^16、ヒト免疫不全ウイルス^{（HIV）17、}および大腸菌 O157：H7 ^18。

マルチプレックスイムノアッセイは同時に単一のサンプルボリューム内および単一サイクルまたは実行中の複数の検体の分析を可能にします。 C.からの多重化抗原ジェジュニ 、T.ゴンジ、ピロリ菌は、A型肝炎ウイルス、および2つのノロウイルスを使用して、これらの病原体に対するヒト唾液のIgGおよびIgA ^{2-4 3,4}および血漿のIgG ^2,3抗体応答を測定するために使用されましたビーズベースの多重化イムノアッセイ。水、土壌、食品中の微生物への曝露の疫学的研究に関連して使用される場合、本研究において記載されるアッセイのタイプは、環境病原体によって引き起こされる感染症の理解を高めるために貴重な情報を提供することができます。また、このような研究から得られた唾液抗体のデータは、リスク評価モデル^19-22を改善するために使用することができます。

プロトコル

承認は、米国の一部として、プエルトリコ、ボケロンビーチでbeachgoersから刺激滲出唾液サンプルを収集するための治験審査委員会（IRB＃08から1844まで、ノースカロライナ大学チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国）から入手しました環境保護庁（USEPA）国立疫学およびレクリエーション（NEEAR）水研究²³の環境アセスメントは、水泳関連エクスポージャーや病気を評価しました。被験者は、インフォームドコンセントを提供し、訓練を受けたUSEPA請負業者によって唾液収集装置の使用を指示されました。唾液サンプルを受信すると、それらを遠心分離し、そして^4に記載のように-80℃で保存し、氷上で輸送しました。

1.ビーズのアクティベーション

1. ボルテックスし、20秒間超音波処理し、マイクロ遠心チューブにストックビーズ（400μL）の転送が約5.0×10 ⁶により再懸濁ビーズセットを取り揃えております。
   注：T彼は、12.5×10 ⁶ビーズ/ mlの濃度で供給されているビーズ。
2. 2分間万×gで遠心分離することにより、在庫ビーズをペレット化。
3. 20秒間ボルテックスし、超音波処理により蒸留水（のdH ₂ O）の上清を除去し、100μlのペレット化したビーズを再懸濁します。繰り返し手順1.2。
4. 上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により100mMの一塩基性リン酸ナトリウム、pHが6.2の80μlの洗浄したビーズを再懸濁します。
5. 使用直前に、10mgのスルホ-NHSのアリコートに200μlののdH ₂ Oを添加することにより、50 mg / mlでN -hydroxysulfosuccinimide（スルホ-NHS）ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。
6. ビーズに50 mg / mlでスルホ-NHSの10μLを加えます。ボルテックスで混ぜます。
7. 使用直前に、10 mgのEDCアリコートに200μlの蒸留水（のdH ₂ O）を添加することにより、50 mg / mlで1-エチル- [3dimethylaminopropyl]カルボジイミド塩酸塩（EDC）ソリューションとなります。ボルテックスで混ぜます。
8. 50の10μLを追加ビーズのmg / mlでEDC溶液。ボルテックスで混ぜます。 10分間隔でボルテックスすることによって混合しながら、暗所で、室温で20分間ビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。
9. 上清を除去し、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、50mMの2- [N-モルホリノ]エタンスルホン酸（MES）、pH5.0の250μlの中でビーズを再懸濁します。
10. 2分間万×gでマイクロ遠心によって活性化ビーズをペレット。
11. 繰り返しは、1.9と1.10を繰り返します。
    注：これはの50mM MES、pHが5.0で2回の洗浄の合計を提供します。
12. 20秒間ボルテックスし、超音波処理によっての50mM MES、pH5.0の100μlの中のビーズを再懸濁します。

2.ビーズカップリング

1. 対を表1に示す濃度を用いてビーズセットの抗原。
2. 活性化ビーズに各抗原を追加し、50mMのMES、pHを5.0に500μlの総容積をもたらします。抗原をミックスAN渦により、Dビーズ。
3. 暗所で室温で回転（〜15回転）で混合しながら2時間のための抗原とビーズをインキュベートします。 2分間万×gでマイクロ遠心によって結合されたビーズをペレット化。
4. 上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水500μlのビーズを再懸濁（PBS）-bovine血清アルブミン（BSA）-polyoxyethylenesorbitanラウレート（ツイーン20） - ナトリウムアジド（PBS-TBN）ボルテックスし、超音波処理することによりpHを7.4。 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット化し、上清を除去します。
   注意：アジ化ナトリウムは急性毒性化学物質です。飲み込んだり皮膚に接触して取得する場合には致命的です。粉じん/煙/ガス/ミスト/蒸気やスプレーを吸入しないこと。取り扱う際は、適切な個人用保護具（P​​PEの）を着用し、適切な法律に従って処分します。
5. 20秒間ボルテックスし、超音波処理によりPBS-TBNの1ミリリットル中のビーズを再懸濁します。
6. 2分間万×gで微量遠心によりビーズをペレット。
7. 繰り返しは、2.5と2.6を繰り返します。
   注：これは、PBS-TBNで2回洗浄の合計を提供します。
8. 1mlのPBS、1％BSA、0.05％アジド、pH​​7.4中で結合し、洗浄したビーズを再懸濁します。暗所で2〜8℃の冷蔵庫に結合されたビーズを保管してください。

3.ビーズカウント

1. 水またはPBS緩衝液中で結合されたビーズの1:10希釈液を準備します。
2. 試料導入点での血球計数器への負荷のビーズ希釈液10μLを。
3. 4×4コーナーグリッドの1に見られるビーズを数えます。以下の式を用いて結合されたビーズの総数を計算する：数（4×4のグリッドの1角）×（1×10 ^4）×（希釈係数）はミリリットルに再懸濁体積をxは。

抗原結合の4確認

1. 20秒間ボルテックスし、超音波処理により、目的の抗原に結合されたビーズの原料混合物を再懸濁します。
2. 最終的に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します100ビーズ/ PBS-1％BSA緩衝液（PBS-1％BSA、pH7.4）中で設定された各固有のビーズμlの濃度。
3. PBS-1％BSA緩衝液を用いて丸底プレートの96ウェルで、製造業者の推奨に従って抗種IgGを一次抗体の少なくとも7 2倍連続希釈液を調製します。
4. 洗浄バッファー100μlの各抗原結合確認試験のための96ウェルフィルター底プレートの別々の8ウェル列（8列）をプリウェット及び真空により上清を除去します。プリウェットウェルに取り組んビーズ混合物（抗原結合ビーズ）の50μLを加えます。
5. バックグラウンドウェルとして機能するように希釈した抗体の代わりに 8行するために、96ウェルフィルタープレートの各列の列1-7とPBS-1％BSA緩衝液の50μlに抗体希釈液50μlを加えます。ピペッティングによって、および5回上下マルチチ​​ャンネルピペッターで混ぜます。確認するように設定し、すべての抗原結合ビーズと同じ手順を実行します。
6. 覆い、室温の暗所でインキュベートすることを可能にします500 rpmでマイクロプレートシェーカー上で1時間erature。真空により上清を取り除きます。
7. 洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。 1倍を繰り返します。マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1％BSA50μlのビーズを再懸濁します。
8. PBS-1％BSA中の16μg/ mlにビオチン化抗種に特異的なIgG二次検出抗体を希釈します。
9. ダウン5回ピペッティングにより各ウェルに希釈した二次抗体を50μl加えます。
10. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
11. マルチチャンネルピペッターを用いてPBS-1％BSA50μlのビーズを再懸濁します。
12. PBS-1％BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）を希釈します。
13. 各ウェルにレポーターの50μLを加え、ピペッティングによって、および5回上下混ぜます。
14. C言語フィルタープレート上、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
15. PBS-1％BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ^29を使用して50μLを分析します。
    注：ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイの結果は、中央値蛍光強度（MFI）で測定されます。エラーを回避するために利用可能な場合は常に、ソフトウェアのマニュアルの最新版を参照してください。

5.唾液マルチプレックスイムノアッセイ

1. -80°Cフリーザーから唾液を外し、室温で解凍することができます。
2. 再懸濁抗原は、20秒間ボルテックスし、超音波処理により、ビーズストックを結合さ。
3. 100ビーズ/ PBS-1％BSA緩衝液で設定した各ユニークなビーズのμlの最終濃度に結合されたビーズストックを希釈することにより、作業ビーズ混合物を準備します。
4. 唾液の4希釈ワット：1を準備します96ウェル、ディープウェルプレート中のPBS-1％BSA緩衝液番目。
5. プリウェットフィルター洗浄緩衝液100μlでプレートと真空により上清を除去します。
6. 8最終希釈：作業ビーズ混合物および1のための96ウェルフィルタープレートの95ウェルに希釈した唾液の同体​​積の50μLを加えます。マルチチャンネルピペッターとの反応を混ぜます。 1つのウェルコントロールに、50μlの抗原結合ビーズプラス（唾液の代替として）PBS-1％BSA緩衝液50μlを追加します。
7. 覆い、500rpmで、マイクロプレートシェーカー上で1時間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
8. マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1％BSA50μlに再懸濁ビーズ。
9. PBS-1％BSAで16 / mlのビオチン化ヤギ抗ヒトIgG二次検出抗体を希釈します。
10. 各ウェルに二次抗体を希釈した50μlのを追加して内容物を混合マルチチャンネルピペッター。
11. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
12. マルチチャンネルピペッターを有するPBS-1％BSA50μlに再懸濁ビーズ。
13. PBS-1％BSA中24 / mlのにストレプトアビジンR-フィコエリトリンレポーター（SAPE）を希釈します。
14. 各ウェルに50μlのレポーターを追加し、マルチチャンネルピペッターで混ぜます。
15. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカー上で30分間室温で暗所でインキュベートすることを可能にします。真空により上清を取り除きます。洗浄緩衝液100μlでウェルを洗浄し、真空により上清を除去します。洗浄1Xを繰り返します。
16. PBS-1％BSAの100μl中に再懸濁ビーズおよびアナライザ^29を使用して50μLを分析します。
    注意：マルチプレックスイムノアッセイの結果は、蛍光強度中央値（MFI）単位で測定されています。常にを参照してください。ソフトウェアマニュアルの最新バージョン、エラーを回避するために利用可能な場合。

結果

一つのユニークなビーズセットは、変動をサンプリングするために、非特異的な結合とサンプルを測定するための対照として使用しました。これらのビーズは、それらがカップリング工程の任意の抗原と共にインキュベートされなかったことを除いて、抗原結合ビーズと同じように処理しました。全唾液試料とインキュベートコントロールビーズから得られた> 500 M...

ディスカッション

これらの結果は、マルチプレックスイムノアッセイ法は、免疫または免疫陰性である唾液サンプルとを区別するために有用であることを示しています。免疫陽性を決定するために、シングルカットオフポイントは、平均+唾液試料のすべてでテスト制御カップリングしていないビーズの対数変換MFI応答の3つの標準偏差を計算することによって開発されました。カットオフポイントは、単一ま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Used to centrifuge samples
Vortex Mixer	VWR	G560	Used to mix samples
Sonicator (mini)	Fisher Scientific	15-337-22	Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	Various
Hemacytometer (Bright Line)	Housser Scientific	3200	Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold	Millipore	MSVMHTS00	Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker	VWR	12620-926	Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)	VWR	30128-346
Weighing Scale	Mettler or other		Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer	Invitrogen	947-01	Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software	Luminex Corporation	LX200-XPON3.1	Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture	Meridian Life Sciences	8505	Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate	Meridian Life Sciences	R14101	Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)	Meridian Life Sciences	R18426	Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells	KPL	50-92-93	Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus	(CCHMC)*	NA	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species	KPL	01-92-93	Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	KPL	176-1506	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)	KPL	16-10-02	Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills	BioVentures	5030050C
200 µL pipette tip refills	BioVentures	5030080C
1000 µL pipette tip refills	BioVentures	5130140C
Aluminum foil	Various Vendors		Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates	VWR	40002-009	Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates	Millipore	MABVN1250	Used to run assays
Oracol saliva collection system	Malvern Medical Developments Limited		Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)	Luminex Corporation	Dependent on bead set	Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	Pierce	77149 or 22980	Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Pierce	24510	Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)	Molecular Probes	S-866	Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	M-2933	Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	Sigma	P-9416	Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	Sigma	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**	Sigma	S-8032	**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)	Sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	Sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN