eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

Zusammenfassung

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Zusammenfassung

Die Ätiologie und die Auswirkungen der Exposition des Menschen gegenüber Umwelt Erreger sind von großer Besorgnis weltweit und damit die Fähigkeit, Belichtung und Infektionen mit kostengünstige, High-Throughput-Ansätze unabdingbar wäre zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Entwicklung und Analyse eines bead-based multiplex Immunoassay Lage sind, die Anwesenheit von Antikörpern in menschlichen Speichel an mehrere Pathogene gleichzeitig messen. Saliva ist besonders attraktiv in dieser Anwendung, da sie nicht invasiv ist, billiger und leichter zu erfassen als Serum. Antigene aus Umweltpathogene wurden an carboxylierte Mikrokügelchen (Perlen) und verwendet, um Antikörper in sehr kleinen Volumina von menschlichen Speichelproben zu messen, eine Perlenbasis, Lösungsphasen-Assay. Die Perlen wurden in Verbindung mit Antigenen von Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviren (G I.1 und G II.4) und Hepatitis - A - Virus. Um sicherzustellen, dass die Antigene wurden ausreichend gekoppeltdie Perlen, Kupplung wurde mit biotinyliertem Anti-Spezies Sekundär Nachweis-Antikörper und Streptavidin-R-Phycoerythrin Reporter (SAPE) unter Verwendung von artspezifischen, von Tieren stammenden primären Fänger-Antikörper, gefolgt von einer Inkubation bestätigt. Als Kontrolle nicht-spezifische Bindung zu messen, wurde ein Beadset identisch zu den anderen behandelt, außer es nicht an Antigen gekoppelt wurde. Die antigen-gekoppelt und Kontrollkügelchen wurden dann mit prospektiv gesammelten menschlichen Speichelproben inkubiert, auf einem Hochdurchsatz-Analysator auf den Prinzipien Durchflusszytometrie basierend gemessen von und die Anwesenheit von Antikörpern gegen jedes Antigen wurde in mittlere Fluoreszenzintensitätseinheiten (MFI), gemessen . Dieser Multiplex-Immunoassay hat eine Reihe von Vorteilen, mehr Daten mit weniger Probe enthält; reduzierte Kosten und Arbeit; und die Fähigkeit, den Test zu viele Ziele von Interesse anzupassen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Speichel Multiplex-Immunoassay-fähig sein kann vorherigen Belichtungen und Infektionen zu identifizieren, die especia sein kannlly nützlich in Beobachtungsstudien großen menschlichen Populationen beteiligt sind.

Einleitung

Eighty-acht Prozent der weltweiten Durchfall-Erkrankungen mit der Exposition des Menschen gegenüber kontaminierten Wasser, unsichere Lebensmittel und schlechte Hygiene / Hygiene verbunden ist, etwa 1,5 Millionen Menschen ums Leben kamen, die meisten davon sind ¹ Kinder. Dies ist ein wichtiger Grund zur Besorgnis für Beamte des öffentlichen Gesundheitswesens und politische Entscheidungsträger. In dem Bemühen , mit wässrigen und anderen Umweltkrankheitserreger assoziiert Belichtungen und Krankheiten zu untersuchen, haben wir eine Multiplex - Immunoassay Antikörper in menschlichen Proben ^2-4 zu messen. Dieses Verfahren kann auf epidemiologische Studien angewendet werden, die Exposition des Menschen auf diese Erreger zu bestimmen und zu einer besseren immunoprevalence und Incident-Infektionen zu definieren.

Saliva hält erhebliche Versprechen als Alternative für den menschlichen Biomarker-Forschung im Serum. Zu den Vorteilen der Verwendung von Speichel sind die Nicht-Invasivität und einfache Probenentnahme, niedrige Kosten, und die Proben leicht von Kindern ^5-7 gesammelt werden kann ^</ Sup>. Serum und Speichelproben wurden ausgiebig für Antikörper gegen H. studierte pylori ^2,3,8, Plasmodium falciparum ^9, Entamoeba histolytica ^10, parvum Cryptosporidium ^3,11, Streptococcus pneumoniae ^12, Hepatitis - Viren A und C ^13-14, Noroviren ^2-4,15, T. gondii ^2-4, Dengue - Virus ^16, human immunodeficiency virus (HIV) ¹⁷ und Escherichia coli O157: H7 ^18.

Ein Multiplex-Immunoassays ermöglicht die Analyse von mehreren Analyten gleichzeitig in einem einzigen Probenvolumen und innerhalb eines einzelnen Zyklus oder laufen. Multiplexed Antigene von C. jejuni, T. gondii, H. pylori, Hepatitis - A - Virus und zwei Noroviren wurden verwendet , um menschliche Speichel IgG ^2-4 und IgA ^3,4 und Plasma - IgG ^2,3 Antikörper - Antworten auf diese Erreger zu messen unter Verwendung einesMultiplexen Immunoassay bead-basiert. Wenn sie in Verbindung mit epidemiologischen Studien der Exposition gegenüber Mikroben in Wasser, Boden und Nahrungsmittel verwendet wird, kann die Art des Assay in dieser Studie beschriebenen wertvolle Informationen liefern, das Verständnis von Infektionen durch Pathogene verursacht Umwelt zu verbessern. Außerdem Speichel Antikörper Daten aus solchen Untersuchungen erhalten wird, kann verwendet werden , um die Risikobewertung Modelle ^19-22 verbessern.

Protokoll

Zustimmung wurde von der Institutional Review Board erhalten (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) für die Sammlung von stimulierter creviculare Speichelproben von beachgoers bei Boquerón Beach, Puerto Rico, als Teil der Vereinigten Staaten Environmental Protection Agency (US - EPA) Nationale Epidemiologische und die Umweltprüfung von Freizeit (Neear) Wasser Studie ²³ zum Schwimmen im Zusammenhang Belichtungen und Krankheiten bewerten. Studienteilnehmer informierten Zustimmung zur Verfügung gestellt und wurden über die Verwendung der Speichelsammelvorrichtung durch geschultes USEPA Auftragnehmer angewiesen. Die Speichelproben wurden auf Eis transportiert und auf den Empfang, wurden sie bei -80 ° C zentrifugiert und gespeichert , wie ⁴ beschrieben.

1. Bead-Aktivierung

1. Resuspendieren Beadset Bestände durch Verwirbelung und Beschallen für 20 Sekunden und Transfer ca. 5,0 x 10 ⁶ der Lager - Perlen (400 ul) zu Mikrozentrifugenröhrchen.
   Hinweis: Ter Perlen werden in einer Konzentration von 12,5 x 10 ⁶ Perlen / ml geliefert.
2. Pellet die Lager Perlen durch bei 10.000 × g für 2 Minuten zentrifugiert.
3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die pelletierten Perlen in 100 ul destilliertem Wasser (dH ₂ O) durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden. Wiederholen Sie Schritt 1.2.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die gewaschenen Perlen in 80 ul 100 mM monobasisches Natriumphosphat, pH 6,2 durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
5. Unmittelbar vor dem Gebrauch machen eine 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) Lösung , die durch Zugabe von 200 & mgr; l dH ₂ O auf 10 mg Sulfo-NHS - Aliquot. Mix von Wirbel.
6. Fügen Sie 10 & mgr; l der 50 mg / ml Sulfo-NHS an die Kügelchen. Mix von Wirbel.
7. Unmittelbar vor dem Gebrauch machen eine 50 mg / ml 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimidhydrochlorid (EDC) -Lösung durch Zugabe von 200 & mgr; l destilliertem Wasser (dH ₂ O) an die 10 mg EDC aliquoten. Mix von Wirbel.
8. In 10 ul 50mg / ml EDC-Lösung an die Kügelchen. Mix von Wirbel. Inkubieren der Perlen für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Mischen mit dem Vortex in 10 min Intervallen. Pellet die aktivierte Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
9. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Kügelchen in 250 ul 50 mM 2- [N - Morpholino] ethansulfonsäure (MES), pH 5,0 durch Vortexen und Ultraschall - Behandlung für 20 Sekunden.
10. Pellet die aktivierte Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
11. Wiederholen Sie die Schritte 1.9 und 1.10.
    Anmerkung: Dies stellt insgesamt zwei Waschungen mit 50 mM MES, pH 5,0.
12. Resuspendieren der Kügelchen in 100 ul 50 mM MES, pH 5,0 durch Vortexen und Ultraschall-Behandlung für 20 Sekunden.

2. Bead Kupplung

1. Paar die Antigene zu den Bead - Sets mit den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen.
2. Fügen Sie jedes Antigen an die aktivierten Perlen und bringen das Gesamtvolumen auf 500 & mgr; l in 50 mM MES, pH-Wert 5,0. Mischen Sie die Antigene eind Perlen durch Wirbel.
3. Inkubieren der Antigene und Perlen für 2 Stunden unter Mischen durch Rotation (~ 15 Upm) bei Raumtemperatur im Dunkeln. Pellet die gekoppelten Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Kügelchen in 500 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -bovine Serumalbumin (BSA) -polyoxyethylenesorbitan Monolaurat (Tween-20) -natrium Azid (PBS-TBN) pH 7,4 durch Vortexen und Ultraschall. Pellet die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
   Vorsicht: Natriumazid ist eine akut toxische Chemikalie. Es ist fatal, wenn sie verschluckt oder kommt in Kontakt mit der Haut. Staub / Rauch / Gas / Nebel / Dampf oder Aerosol nicht einatmen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PPE) beim Umgang mit und entsorgen in Übereinstimmung mit den entsprechenden Gesetzen.
5. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS-TBN von Vortexen und Ultraschall-Behandlung für 20 Sekunden.
6. Pellet die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6.
   Anmerkung: Dies stellt insgesamt zwei Waschungen mit PBS-TBN.
8. Resuspendieren der gewaschenen Kügelchen gekoppelt und in 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% Azid, pH 7,4. Lagern Sie die gekoppelten Kügelchen in einer 2-8 ° C Kühlschrank im Dunkeln.

3. Bead Graf

1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:10 der gekoppelten Kügelchen in Wasser oder PBS-Puffer.
2. Last 10 ul der Wulst Verdünnung auf einem Hämozytometer an der Probeneinleitungspunkt.
3. Zählen Sie die gesehen Perlen in einem der 4 x 4 Ecke Gitter. Berechnen der Gesamtzahl der gekoppelten Kügelchen mit der folgenden Formel: Count (1 - Ecke von 4 x 4 Gitter) x (1 x 10 & ^sup4 ; ) x (Verdünnungsfaktor) x Resuspension Volumen in ml.

4. Bestätigung von Antigen Kupplung

1. Resuspendieren Lager Mischung von Kügelchen gekoppelt Antigene von Interesse durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
2. Bereiten Sie eine Arbeits Perlen-Mischung durch die gekoppelten Wulst Aktien bis zu einer endgültigen VerdünnungKonzentration von 100 Perlen / ul jeder einzigartige Perle in PBS-1% BSA-Puffer (PBS-1% BSA, pH 7,4) eingestellt.
3. Bereiten Sie mindestens 7 zweifache serielle Verdünnungen von Anti-Spezies-IgG primärer Antikörper gemäß den Empfehlungen des Herstellers in 96-Well-Rundbodenplatte mit PBS-1% BSA-Puffer.
4. Vorbefeuchtenden eine separate 8-Well-Säule (8 Zeilen) einer 96-Well-Filterbodenplatte für jedes Antigen Kupplungsbestätigungstest mit 100 ul Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Werden 50 & mgr; l Arbeits bead Mischung (antigen-gekoppelten Kügelchen) zu den vorbefeuchtenden Brunnen.
5. Zugabe von 50 & mgr; l der Antikörperverdünnungen auf Zeilen 1-7 von jeder Spalte der 96-Well - Filterplatte , und 50 ul PBS-1% BSA - Puffer 8 anstelle des verdünnten Antikörpers zu Zeile als Hintergrundvertiefungen dienen. Mischen Sie mit einem Multi-Kanal-Pipette pipettiert, nach oben und unten 5-mal. Führen Sie die gleiche Prozedur für jedes Antigen-gekoppelte Beadset bestätigt werden.
6. Zudecken und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubierteratur für 1 h auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei 500 rpm. Überstand entfernen durch Vakuum.
7. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen 1x. Resuspendieren der Kügelchen in 50 & mgr; l PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
8. Verdünnter biotinylierter anti-Spezies-spezifischen IgG sekundären Detektionsantikörper zu 16 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
9. In 50 ul des verdünnten sekundären Antikörper zu jeder Vertiefung durch Auf- und Abpipettieren 5-mal.
10. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
11. Resuspendieren der Kügelchen in 50 & mgr; l PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
12. Verdünnte Streptavidin-R-Phycoerythrin reporter (SAPE) bis 24 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
13. In 50 ul Reporter in jede Vertiefung und mischen durch Pipettieren auf und ab 5 mal.
14. CFilterplatte über und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
15. Resuspendieren Perlen in 100 ul PBS-1% BSA und 50 ul analysieren ²⁹ mit dem Analysator.
    Hinweis: Die Ergebnisse des Wulstes basierten multiplex-Immunoassay gemessen in mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). Bezieht sich immer auf die neueste Version der Software-Handbuch, falls vorhanden, Fehler zu vermeiden.

5. Speichel- Multiplex-Immunoassay

1. Entfernen Sie Speichel aus dem -80 ° C Gefrierschrank und bei Raumtemperatur auftauen.
2. Resuspendieren Antigen gekoppelt Wulst Aktien durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
3. Bereiten Sie eine Arbeits Perlen-Mischung durch die gekoppelten Wulst Aktien bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 Perlen Verdünnung / ul jeder einzigartigen Beadset in PBS-1% BSA-Puffer.
4. Bereiten Sie eine 1: 4-Verdünnung des Speichels with PBS-1% BSA-Puffer in einer 96-Well, Deep-Well-Platte.
5. Vornässen Filterplatte mit 100 ul Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum.
6. Werden 50 ul einer Arbeits bead Mischung und ein gleiches Volumen von verdünntem Speichel zu 95 Wells der 96-Well-Filterplatten für eine 1: 8 Endverdünnung. Mischungs Reaktionen mit einem Mehrkanal-Pipettor. Zum einen Steuer gut, fügen Sie 50 ul Antigen-gekoppelten Kügelchen plus 50 ul PBS-1% BSA-Puffer (als Ersatz für Speichel).
7. Zudecken und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei 500 rpm inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
8. Resuspendieren Perlen in 50 ul PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
9. Verdünnte biotinyliertem Ziege-anti-human IgG sekundären Detektionsantikörper zu 16 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
10. In 50 ul zu jeder Vertiefung sekundären Antikörper verdünnt und mischen Inhalte mitein Mehrkanal-Pipettor.
11. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
12. Resuspendieren Perlen in 50 ul PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
13. Verdünnte Streptavidin-R-Phycoerythrin reporter (SAPE) bis 24 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
14. In 50 ul Reporter in jede Vertiefung und mischen mit einem Multi-Kanal-Pipette.
15. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
16. Resuspendieren Perlen in 100 ul PBS-1% BSA und 50 ul analysieren ²⁹ mit dem Analysator.
    Hinweis: Die Ergebnisse des Multiplex-Immunoassays sind in mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) -Einheiten gemessen. Informieren Sie sich beidie neueste Version der Software-Handbuch, falls vorhanden, Fehler zu vermeiden.

Ergebnisse

Eine einzigartige Perle Set wurde als Kontrolle zur Messung der unspezifischen Bindung und Probe Variabilität zu probieren. Diese Kügelchen wurden identisch zu den Antigen gekoppelten Kügelchen mit der Ausnahme behandelt, daß sie nicht mit einem Antigen in der Kopplungsschritt inkubiert. MFI-Werte> 500 von den Kontrollkügelchen mit allen Speichelproben inkubiert erhalten wurden von der weiteren entfernt Analysen aufgrund vermuteter Kontamination von Serum und die restlichen Antwo...

Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Multiplex-Immunoassay-Verfahren ist nützlich zum Unterscheiden zwischen Speichelproben, die immunopositive oder immunonegative sind. Um zu bestimmen, immunopositivity wurde durch Berechnung der Mittelwert plus drei Standardabweichungen der log transformierten MFI Reaktionen der Steuerung abgekoppelt Perlen eine einzige Grenzpunkt mit all den Speichelproben getestet entwickelt. Der Cut-off-Punkt die Fähigkeit zur Beurteilung der Belichtung und immunoprevalence entweder eine einzelne od...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Used to centrifuge samples
Vortex Mixer	VWR	G560	Used to mix samples
Sonicator (mini)	Fisher Scientific	15-337-22	Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	Various
Hemacytometer (Bright Line)	Housser Scientific	3200	Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold	Millipore	MSVMHTS00	Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker	VWR	12620-926	Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)	VWR	30128-346
Weighing Scale	Mettler or other		Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer	Invitrogen	947-01	Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software	Luminex Corporation	LX200-XPON3.1	Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture	Meridian Life Sciences	8505	Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate	Meridian Life Sciences	R14101	Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)	Meridian Life Sciences	R18426	Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells	KPL	50-92-93	Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus	(CCHMC)*	NA	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species	KPL	01-92-93	Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	KPL	176-1506	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)	KPL	16-10-02	Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills	BioVentures	5030050C
200 µL pipette tip refills	BioVentures	5030080C
1000 µL pipette tip refills	BioVentures	5130140C
Aluminum foil	Various Vendors		Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates	VWR	40002-009	Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates	Millipore	MABVN1250	Used to run assays
Oracol saliva collection system	Malvern Medical Developments Limited		Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)	Luminex Corporation	Dependent on bead set	Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	Pierce	77149 or 22980	Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Pierce	24510	Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)	Molecular Probes	S-866	Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	M-2933	Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	Sigma	P-9416	Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	Sigma	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**	Sigma	S-8032	**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)	Sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	Sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN