JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Abstract

האטיולוגיה ואת ההשפעות של חשיפה אנושית פתוגנים סביבתיים הם של דאגה גדולה ברחבי העולם, ובכך, את היכולת להעריך באמצעות חשיפה וזיהומים חסכוניות, גישות תפוקה גבוהה תהיה הכרחית. כתב יד זה מתאר את ההתפתחות וניתוח של immunoassay זמנית מבוסס חרוז ליכולת למדוד את הנוכחות של נוגדנים ברוק אדם פתוגנים רב בו זמנית. רוק הוא אטרקטיבי במיוחד ביישום זה בגלל זה אינו פולשני, זול יותר וקל יותר לאסוף מ בסרום. אנטיגנים של פתוגנים סביבתיים היו מצמידים את microspheres carboxylated (חרוזים) ומשמשים למדידת נוגדנים בנפחים קטנים מאוד של דגימות רוק אנושיים באמצעות assay מבוסס חרוז, פתרון פאזיים. חרוזים היו מצמידים עם אנטיגנים מ קמפילובקטר jejuni, הליקובקטר פילורי, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 ו- G II.4) ודלקת כבד נגיפית A וירוס. כדי להבטיח כי אנטיגנים היו מצמידים מספיק כדיהחרוזים, צימוד אושרו באמצעות נוגדני מינים ספציפיים, לכידה עיקרית-מחי, ואחריו דגירה עם נוגדני איתור משני אנטי-מיני biotinylated כתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE). כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב, סט חרוז אחד טופל באופן זהה לאחרים אלא שזה לא היה מצמיד את כל אנטיגן. האנטיגן מצמיד ובקרת חרוזי הודגרו אז עם דגימות רוק אנושיות-שנאספו פרוספקטיבית, נמדדו על נתח תפוקה גבוהה על בסיס העקרונות של cytometry זרימה, ואת הנוכחות של נוגדנים לכל אנטיגן נמדדה ביחידות עוצמות קרינה החציונית (MFI) . יש immunoassay זמנית זו מספר יתרונות, כולל נתונים נוספים עם מדגם פחות; עלויות עבודה מופחתות; ואת היכולת להתאים את assay מטרות רבות של עניין. תוצאות מחקר מראים כי immunoassay זמנית הרוק עשויה להיות מסוגל לזהות חשיפות וזיהומים קודמים, אשר יכול להיות especially שימושי במחקרי מעקב המעורבים אוכלוסיות אנושיות גדולות.

Introduction

שימונים ושמונה אחוזים של מחלה הקשורים שלשולים ברחבי העולם קשור לחשיפת אדם למים מזוהמים, מזון בטוח, והיגיינה / תברואה הירודה, גרימה כ -1.5 מיליון מקרי מוות, רובם הם ילדים 1. זהו גורם עיקרי לדאגה עבור אנשי בריאות ציבור וקובעי מדיניות. במאמץ לחקור חשיפות ומחלות הקשורות waterborne ופתוגנים סביבתיים אחרים, פיתחנו immunoassay זמנית למדוד נוגדנים בדגימות אדם 2-4. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אפידמיולוגיים לקבוע חשיפה אנושית פתוגנים אלה עדיף להגדיר זיהומי immunoprevalence ואירוע.

רוק טומן בחובו הבטחה ניכרה כחלופת סרום המחקר ביו-מרקר אדם. בין היתרונות של שימוש רוק הם-הפולשנות הלא וקלות אוסף מדגם, בעלות נמוכה, ודוגמאות ניתן לאסוף בקלות מילדים 5-7 </ Sup>. סרום דגימות רוק נחקרו רבות עבור נוגדנים כנגד H. פילורי 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס 12, וירוסים הפטיטיס A ו- C 13-14, noroviruses 2-4,15, ט גונדי 2-4, דנגה וירוס 16, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 17, ו Escherichia coli O157: H7 18.

Immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של analytes מרובים בו זמנית בתוך נפח דגימה אחת ותוך מחזור אחד או לרוץ. אנטיגנים Multiplexed מ ג jejuni, ט גונדי, H. pylori, הפטיטיס וירוס, ושני noroviruses שמש למדידת אדם רוק IgG 2-4 ו IgA 3,4 ופלזמת תגובות 2,3 נוגדן IgG לפתוגנים אלה באמצעותחרוז מבוסס ריבוב immunoassay. הפועל בשיתוף עם מחקרים אפידמיולוגיים של חשיפה לחיידקים במים, אדמה ומזון, הסוג של assay המתואר במחקר זה עשוי לספק מידע רב ערך על מנת לשפר את ההבנה של זיהומים הנגרמים על ידי פתוגנים סביבתיים. יתר על כן, נתוני נוגדן רוק שהתקבלו ממחקרים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר את המודלים להערכת סיכוני 19-22.

Protocol

התקבל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB # 08-1844, אוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל, צפון קרוליינה, ארה"ב) לאיסוף דגימות רוק crevicular מגורה מ beachgoers בחוף Boqueron, פורטו ריקו, כחלק ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה (USEPA) הלאומי אפידמיולוגיים הערכה סביבתית של פנאי (NEEAR) מים לימוד 23 להעריך הקשורים שחייה חשיפות ומחלות. משתתפי המחקר סיפקו הסכמה מדעת הונחו על השימוש בהתקן אוסף הרוק ידי קבלנים USEPA מאומן. דגימות הרוק נשלחו על קרח, עם קבלה, הם היו centrifuged ומאוחסנים ב -80 ° C כמתואר 4.

1. הפעלת חרוז

  1. מניות סט חרוז גלולה ידי vortexing ו sonicating במשך 20 שניות ולהעביר כ 5.0 x 10 6 של חרוזים המניות (400 μl) צינורות microcentrifuge.
    הערה: Tהוא החרוזים מסופקים בריכוז של 12.5 x 10 6 חרוזים / ml.
  2. גלולת חרוזי המניות על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  3. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים pelleted ב 100 μl מים מזוקקים (DH 2 O) על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. חזור על שלב 1.2.
  4. הסר את supernatant ו resuspend חרוזים שטף ב -80 μl של 100 monobasic נתרן פוספט מ"מ, pH 6.2 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  5. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) הפתרון על ידי הוספת 200 μl DH 2 O ל aliquot 10 מ"ג sulfo-NHS. מערבבים על ידי מערבולת.
  6. הוסף 10 μl של 50 מ"ג / מ"ל ​​sulfo-NHS על חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת.
  7. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] hydrochloride carbodiimide (EDC) הפתרון על ידי הוספת 200 μl מים מזוקקים (DH 2 O) אל aliquot 10 מ"ג EDC. מערבבים על ידי מערבולת.
  8. הוסף 10 μl של 50מ"ג / מ"ל ​​פתרון EDC אל חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת. דגירה חרוזים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך, עם ערבוב ידי מערבולת ב 10 מרווחי דקות. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  9. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 250 μl של 50 מ"מ 2 [N -Morpholino] חומצה ethanesulfonic (MES), pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  10. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  11. חזור על שלבים 1.9 ו 1.10.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם 50 מ"מ MES, pH 5.0.
  12. Resuspend את החרוזים 100 μl של 50 MES מ"מ, pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.

2. חרוז זיווגים

  1. זוג אנטיגנים על הסטים החרוזים באמצעות הריכוזים שניתן לראות בטבלת 1.
  2. הוסף כל אנטיגן כדי חרוזים מופעל ולהביא את הנפח הכולל עד 500 μl ב 50 מ"מ MES, pH 5.0. מערבבים את האנטיגניםחרוזי ד ידי מערבולת.
  3. דגירה אנטיגנים וחרוזים עבור שעה 2 עם ערבוב על ידי סיבוב (~ 15 סל"ד) בטמפרטורת החדר בחושך. גלולת החרוזים מצמידים ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  4. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 500 μl של בופר פוספט (PBS) אלבומין -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium אזיד (PBS-TBN) pH 7.4 ידי מערבולת sonication. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.
    זהירות: אזיד הנתרן הוא כימיקל רעיל בחריפות. זה קטלני אם בלע או מקבל במגע עם העור. לא לנשום אבק / קטר / גז / ערפל / אדים או תרסיס. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE של) בעת טיפול ולהיפטר בהתאם לחוקים המתאימים.
  5. Resuspend את החרוזים 1 מ"ל של PBS-TBN ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  6. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו -2.6.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם PBS-TBN.
  8. Resuspend החרוזים מצמידים ורחץ ב 1 מ"ל של PBS, 1% BSA, 0.05% אזיד, pH 7.4. אחסן את החרוזים מצמידים במקרר 2-8 מעלות צלזיוס בחושך.

3. ספירת חרוז

  1. כן 1:10 דילול של החרוזים בשילוב במים או חיץ PBS.
  2. טען 10 μl של דילול חרוז גבי hemocytometer בנקודת מבוא המדגם.
  3. רוזן חרוז ראה באחד הרשתות בפינה 4 x 4. חשב את המספר הכולל של חרוזים מצמידים באמצעות הנוסחה הבאה: הרוזן (1 בפינת 4 x 4 רשת) x (1 x 10 4) x (גורם לדילול) x resuspension נפח מ"ל.

4. אישור של Antigen זיווגים

  1. Resuspend את תערובת המניות של חרוזי מצמידי אנטיגנים של עניין על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  2. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים את סופיריכוז של 100 חרוזים / μl של כל חרוז ייחודי להגדיר במאגר PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7.4).
  3. הכן לפחות 7 שני דילולי סדרה של מינים אנטי נוגדני IgG עיקריים על פי המלצות היצרן בצלחת תחתונה 96-גם עגולה עם חיץ BSA% PBS-1.
  4. טרום להרטיב טור 8-גם נפרד (8 שורות) של צלחת 96-גם מסנן תחתונה עבור כל בדיקת אישור צימוד אנטיגן עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. הוסף 50 μl של עובד תערובת חרוז (חרוזי מצמידי אנטיגן) אל הבארות טרום הרטובות.
  5. הוסף 50 μl של דילולים נוגדנים שורות 1-7 של כל עמודה של צלחת מסנן 96-היטב 50 μl של חיץ PBS-1% BSA לחתור 8 במקום נוגדן מדולל לשמש בארות רקע. מערבבים עם פיפטור רב ערוצית על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. בצע אותו התהליך עבור כל סט חרוז מצמידי אנטיגן כדי להיות מאושר.
  6. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפ 'החדרerature עבור שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום.
  7. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור 1x. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  8. לדלל biotinylated אנטי-מינים ספציפיים נוגדן זיהוי משני IgG ל -16 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA% PBS-1.
  9. הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדולל היטב כל על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  10. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  11. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  12. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  13. הוסף 50 μl של כתב היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  14. Cמעל צלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  15. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית מבוסס החרוז נמדדות בעוצמת קרינת חציון (MFI). תמיד מתייחס לגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

5. הרוק Multiplex Immunoassay

  1. סר רוק מהמקפיא -80 ° C ולאפשר להפשיר בטמפרטורת חדר.
  2. Resuspend אנטיגן מצמיד מניות חרוז ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  3. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים לריכוז סופי של 100 חרוזים / μl של כל קבוצה חרוז ייחודי חיץ BSA% PBS-1.
  4. הכן דילול 1: 4 של הרוק wה- i-PBS 1% חיץ BSA בתוך 96 באר, צלחת באר עמוקה.
  5. צלחת מסנן טרום רטוב עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום.
  6. הוסף 50 μl של תערובת חרוז עבודת נפח שווה של רוק מדולל ל 95 בארות של 96 הצלחות המסננות גם עבור דילול 1: סופי 8. מערבב תגובות עם פיפטור רב ערוצים. הפיקוח אחד היטב, מוסיפים 50 חרוזים μl מצמידים אנטיגן פלוס 50 μl של חיץ PBS-1% BSA (כתחליף הרוק).
  7. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  8. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  9. לדלל נוגדן זיהוי משני אנטי אנושי עז biotinylated IgG ל -16 מ"ל מיקרוגרם / ב BSA% PBS-1.
  10. הוסף 50 μl מדולל נוגדנים משני זה טוב ומערבבים תוכן עםפיפטור רב ערוצים.
  11. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  12. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  13. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  14. הוסף 50 μl כתב היטב כל ומערבבים עם פיפטור רב ערוצים.
  15. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  16. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית נמדדות Intensity חציון הקרינה (MFI) יחידות. תמיד מתייחסיםאת הגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

תוצאות

סט חרוז ייחודי אחת שמש כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב מדגם לדגום השתנות. חרוזים אלה טופלו באופן זהה חרוזים בשילוב אנטיגן למעט העובדה שהם לא הודגרו עם כל אנטיגן בשלב צימוד. ערכי MFI> 500 מתקבל החרוזים המלאים מודגרות עם כל דגימות הרוק הוצאו עוד מנתח עקב ...

Discussion

תוצאות אלו מצביעות כי השיטה immunoassay זמנית שימושי להפלות בין דגימות רוק כי הם immunopositive או immunonegative. כדי לקבוע immunopositivity, נקודה אחת חתוכים פותחה על ידי חישוב הממוצע פלוס שלוש סטיות תקן מן תגובות MFI טרנספורמציה יומן של החרוזים המלאים הזוגיים נבדקו עם כל דגימות הרוק. הנקודה ה?...

Disclosures

הסוכנות להגנת הסביבה בארצות הברית באמצעות אופיס של מחקר ופיתוח במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. זה כבר נתון הביקורת המנהלית של הסוכנות ואושר לפרסום. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

Acknowledgements

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Software
MicrocentrifugeThermo Electron Corporation75002446Used to centrifuge samples
Vortex MixerVWRG560Used to mix samples
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.CappVarious
Hemacytometer (Bright Line)Housser Scientific 3200Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum ManifoldMilliporeMSVMHTS00Used in washing steps to remove supernatant
MicroShakerVWR12620-926Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted)VWR30128-346
Weighing ScaleMettler or otherUsed to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUsed to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 softwareLuminex CorporationLX200-XPON3.1Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell cultureMeridian Life Sciences8505Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysateMeridian Life SciencesR14101Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cellsKPL50-92-93Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus(CCHMC)*NAUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pyloriKPL01-93-94Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter speciesKPL01-92-93Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)KPL16-13-06Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)KPL16-18-06Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L)KPL176-1506Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubesUSA Scientific1415-2500Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refillsBioVentures5030050C
200 µl pipette tip refillsBioVentures5030080C
1,000 µl pipette tip refillsBioVentures5130140C
Aluminum foilVarious VendorsUsed keep beads in the dark during incubations
Deep Well platesVWR40002-009Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter PlatesMilliporeMABVN1250Used to run assays
Oracol saliva collection systemMalvern Medical Developments LimitedUsed for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)Luminex CorporationDependent on bead setAntigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)Pierce77149 or 22980Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce24510Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml)Molecular ProbesS-866Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaM-2933Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)SigmaP-9416Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSASigmaA-78880.1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**SigmaS-8032**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)SigmaS-31390.1 M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115Multipleximmunoassaymicrospheres carboxylated

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved