Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir

Özet

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Özet

etiyoloji ve çevresel patojenlere karşı insan maruziyet etkileri dolayısıyla, pozlama ve enfeksiyonlar kullanarak maliyetli, yüksek hacimli yaklaşımları değerlendirmek yeteneği vazgeçilmez olacağını, dünya çapında önemli bir endişe ve. Bu yazıda, aynı anda birden fazla patojen insan tükürük antikorların varlığı ölçebilen bir tane bazlı çoklu immunoassay geliştirilmesi ve analizini açıklamaktadır. o, invaziv olmayan ucuz ve serum daha toplamak için kolaydır çünkü tükürük bu uygulamada özellikle çekici. Çevresel patojenlerinin antijenlerinin karboksillenmiş mikrosferler (taneleri) birleştirilmiş bir tane bazlı, solüsyon faz tahlili kullanılarak insan tükürük örnekleri çok küçük hacimlerde antikorları ölçmek için kullanılmıştır. Boncuk Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviruses (G I.1 ve G II.4) antijenleri ve hepatit A virüsü ile birleştirildi. antijenler yeterli birleştirildi sağlamakboncuklar, birleştirme biyotinlenmiş anti-tür ikincil bir saptama antikorları ve streptavidin-R-fikoeritrin muhabir (SAPE) ile kuluçkalandı ve ardından, türe-özgü, hayvansal kaynaklı primer yakalama antikorları kullanılarak teyit edildi. herhangi bir antijene bağlı değildi dışında spesifik olmayan ölçmek için bir kontrol olarak, bir boncuk grubu diğerlerine aynı işleme tabi tutuldu. antijen bağlı olan ve kontrol tanesi, daha sonra akış sitometrisi ilkelerine göre yüksek bir verim Analyzer üzerinde ölçülen, ileriye yönelik olarak toplanan, insan tükürük numuneleri ile inkübe edilmiştir, ve her bir antijene karşı antikorlar, ortalama florasan yoğunluğu birimleri (MFI) ölçüldü . Bu multipleks immunoassay daha az numune ile daha fazla veri içeren avantajlar, bir numarası vardır; azaltılmış maliyetler ve işçilik; ve yetenek ilgi birçok hedefleri tahlil özelleştirmek için. Sonuçlar tükrük çoklu bağışıklık especia olabilir, daha önceki maruz ve enfeksiyonları belirleme yeteneğine sahip olabileceğini göstermektedirBüyük insan topluluklarını kapsayan gözetim çalışmalarında Lly faydalıdır.

Giriş

Ishal ilişkili hastalık seksen sekiz yüzde dünya çapında yaklaşık 1.5 milyon ölüme neden, kirli su insan maruz güvensiz gıda ve kötü sanitasyon / hijyen ile ilişkilidir, çoğunluğu çocuk ¹ bulunmaktadır. Bu halk sağlığı yetkilileri ve politika yapıcılar için endişe önemli bir nedenidir. Su bazlı ve diğer çevresel patojenler ile ilişkili pozlama ve hastalıkları araştırmak için bir çaba, insan örneklerinde ^2-4 antikorları ölçmek için bir multipleks immunoassay geliştirdi. Bu yöntem, bu patojenlere maruz kalma belirlemek ve daha iyi immunoprevalence ve olay enfeksiyonları tanımlamak için epidemiyolojik çalışmalar uygulanabilir.

Tükürük insan biyomarker araştırma için serum alternatif olarak önemli söz sahibidir. Tükürük kullanmanın avantajları arasında non-invaziv ve numune toplama, düşük maliyet kolaylığı vardır, ve numuneler kolayca çocukların ^{5-7 / Sup>. Serum ve tükürük örnekleri H. karşı antikorlar için yoğun çalışmalar yapılmıştır pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatit virüsleri A ve C 13-14, Noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dang humması virüsü 16, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), 17 ve Escherichia coli O157: H7 18.}

Bir çoklu immünolojik eş zamanlı olarak tek bir örnek hacmi içinde ve bir döngü veya çalışmasında çok analit analizi sağlar. C Çoklanmış antijenler jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatit A virüsü, ve iki Noroviruses bir kullanarak bu patojenler, insan tükürük IgG ^2-4 ve IgA ^3,4 ve plazma IgG ^2,3 antikor tepkilerini ölçmek için kullanılmıştırBoncuk esaslı çoklayıcı immüno. su, toprak ve gıda mikroplara maruz kalma epidemiyolojik çalışmalar ile birlikte kullanıldığında, bu çalışmada açıklanan testin tipi çevre patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların anlayışı geliştirmek için değerli bilgiler verebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalarda elde edilen tükürük antikor veriler risk değerlendirmesi modelleri ^19-22 geliştirmek için kullanılabilir.

Protokol

Onay (KİK # 08-1844, Kuzey Karolina, Chapel Hill, NC, USA Üniversitesi) Boquerón Beach, Porto Riko, en beachgoers gelen uyarılmış oluğu tükürük örneklerinin toplanması için Amerika Birleşik Devletleri'nde bir parçası olarak Kurumsal Değerlendirme Kurulu elde edildi çevre Koruma Ajansı (USEPA) Milli Epidemiyolojik ve Dinlenme (NEEAR) Su Çalışması ²³ çevresel Değerlendirme yüzme ilişkili risklerini ve hastalıkları değerlendirmek için. Çalışma konuları bilgilendirilmiş onam sağlanan ve eğitimli USEPA yükleniciler tarafından tükürük toplama cihazının kullanımı ile ilgili talimatı verildi. Tükürük numuneleri alınması üzerine, bu santrifüjlenmiş ve ⁴ anlatıldığı gibi -80 ° C'de saklandı, buz üzerinde taşınmıştır ve bulundu.

1. Boncuk Aktivasyon

1. Vorteks ve 20 saniye sonicating ve mikrosantrifüj tüplerine stok boncuk (400 ul) transferi yaklaşık 5.0 x 10 ⁶ tarafından süspanse boncuk seti stokları.
   Not: TO 12.5 x 10 ⁶ boncuk / ml'lik bir konsantrasyonda temin edilmektedir boncuk.
2. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de santrifüj edilerek stok boncuk pelet.
3. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile damıtılmış su (dH ₂ O) Süpernatantı ve 100 ul pelet boncuklar tekrar süspansiyon. Adımı tekrarlayın 1.2.
4. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 100 mM sodyum fosfat monobazik, pH 6.2, 80 ul yıkandı boncuklar tekrar süspansiyon.
5. Kullanımdan hemen önce, 10 mg Sülfo-NHS kana 200 ul dH ₂ O eklenerek 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sülfo-NHS) çözüm. girdap ile karıştırın.
6. Boncuklar 50 mg / ml Sülfo-NHS 10 ul ekle. girdap ile karıştırın.
7. Kullanımdan hemen önce, 10 mg EDC kana 200 uL damıtılmış su (DH ₂ O) eklenerek 50 mg / ml 1-etil- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) çözüm. girdap ile karıştırın.
8. 50 10 ul ekleyintanelere mg / ml EDC çözeltisi. girdap ile karıştırın. 10 dakika aralıklarla girdap karıştırma ile, karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
9. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile, 50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit (MES), pH 5.0, 250 ul içinde yeniden süspanse boncuklar.
10. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
11. Tekrarlayın 1.9 ve 1.10 adımları.
    Not: Bu, 50 mM MES, pH 5.0 ile iki kez yıkamadan toplam sağlar.
12. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 50 mM MES, pH 5.0, 100 ul boncuk tekrar.

2. Boncuk Kaplin

1. Çift Tablo 1 'de gösterilen konsantrasyonları kullanılarak kordon kümelerine antijenler.
2. aktive boncuklar, her antijen ekleyin ve 50 mM MES, pH 5.0 içinde 500 ul toplam hacim getirmek. antijenleri karıştırın birgirdap tarafından d boncuklar.
3. karanlıkta, oda sıcaklığında dönme (~ 15 dak) karıştırma ile 2 saat süre ile, antijenleri ve boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile bağlanmış boncuk Pelet.
4. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ul içinde yeniden süspanse boncuklar (PBS) -bovine serum albümini (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) -sodyum azid (PBS-TBN) girdap ve sonikasyon ile pH 7.4 ile yıkanır. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak.
   Dikkat: Sodyum azid bir akut toksik bir kimyasaldır. Yutma veya cilt ile temasında alırsa o ölümcüldür. Toz / duman / gaz / sis / buhar veya sprey teneffüs etmeyin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) 'ın işlerken giyin ve uygun kanunlara uygun olarak bertaraf edin.
5. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile PBS-TBN 1 ml boncuk tekrar.
6. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüje edilerek boncuk Pelet.
7. Tekrarlayın 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
   Not: Bu PBS-TBN ile iki yıkar toplam sağlar.
8. 1 ml PBS,% 1 BSA,% 0.05 azid, pH 7.4 içinde bağlı ve yıkandı boncuk süspanse. karanlıkta 2-8 ° C buzdolabı bağlanmış boncuklar saklayın.

3. Boncuk Sayısı

1. su veya PBS tamponu içinde bağlanmış boncuk 1:10 seyreltme hazırlayın.
2. Yük örnek tanıtım noktasında bir hemasitometre üzerine boncuk seyreltme 10 ul.
3. 4 x 4 köşe ızgaraları birinde görülen boncuk sayın. Kont (4 x 4 ızgara 1 köşesi) x (1 x 10 ⁴⁾ x (seyreltme faktörü) ml x tabanda hacmi: aşağıdaki formül kullanılarak birleştiğinde boncuk toplam sayısını hesaplayın.

Antijen bağlamalar 4. Onay

1. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile ilgi antijenlere birleştiğinde boncuk stok karışımı tekrar süspansiyon.
2. nihai bağlanmış boncuk stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayınPBS-% 1 BSA tamponu (PBS% 1 BSA, pH 7.4) içinde belirlenen her bir benzersiz boncuk / ml, 100 boncuk konsantrasyonu.
3. en az 7 PBS-% 1 BSA tamponu ile 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın üreticinin tavsiyelerine göre IgG primer antikor anti-tür seri seyreltileri iki misli hazırlayın.
4. Yıkama tamponu, 100 ul her bir antijen birleştirme doğrulama testi için 96 oyuklu filtre taban plakasının ayrı bir 8 oyuklu kolonu (8 sıra) önceden ıslak ve vakum ile süpernatantı. Önceden ıslak oyuklara boncuk karışımı (antijene bağlanan boncuklar) Çalışma 50 ul ekle.
5. Arka plandaki kuyulara olarak hizmet seyreltilmiş antikor yerine 8 satır 96-çukurlu bir filtre plakasının her bir sütunun satır 1-7 ve PBS% 1 BSA tamponu 50 ul antikor seyreltileri 50 ul ekle. pipetleme ile 5 kez aşağı çok kanallı bir pipet ile karıştırılır. Her antijen birleştiğinde boncuk seti için aynı prosedürü uygulayın teyit edilecek.
6. Kapak ve oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin500 rpm'de bir mikro çalkalayıcı içinde 1 saat süre ile kısa süreli olarak. vakum ile süpernatantı.
7. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. 1x tekrarlayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
8. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile anti-türe özel IgG sekonder antikor saptama seyreltilir.
9. aşağı 5 kez yukarı pipetleme ve her kuyuya seyreltilmiş ikincil antikor 50 ul ekleyin.
10. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
11. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
12. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
13. her muhabir 50 ul iyi ekleyin ve yukarı pipetleme ve 5 kez aşağı karıştırın.
14. Cve filtre plakası üzerine bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
15. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı ²⁹ ile 50 ul analiz eder.
    Not: tane bazlı çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. hataları önlemek için varsa, her zaman, yazılım kılavuzunun en son sürümü bakın.

5. Tükürük Multiplex İmmunoassay

1. -80 ° C dondurucu tükürük alınır ve oda sıcaklığında erimeye sağlar.
2. Süspanse antijen 20 saniye vorteks ve sonikasyon ile boncuk stokları birleştiğinde.
3. PBS-% 1 BSA tampon içinde benzersiz her boncuk grubunun / ml, 100 boncuk nihai konsantrasyona bağlı kordon stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayın.
4. tükürük 4 seyreltme w: 1 hazırlayınPBS-% 1 BSA, 96 tampon de, derin oyuklu plakaya i.
5. Ön ıslak filtre yıkama tamponu 100 ul ile plaka ve vakum ile süpernatant kaldırmak.
6. 8 nihai seyreltme: çalışan bir boncuk karışımı ve 1 96 oyuklu filtre plakası 95 oyuklarına seyreltildi tükürük, eşit hacimde 50 ul ekle. Çok kanallı bir pipet ile reaksiyonları karıştırın. de birinin kontrol edilmesi için, 50 ul antijen bağlanan boncuklar artı (tükürük için bir yedek olarak) PBS-% 1 BSA tampon 50 ul ekle.
7. Kapak 500 rpm'de bir mikro-plaka çalkalayıcıda 1 saat süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe sağlar. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
8. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
9. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile edilmiş keçi anti-insan IgG ikincil antikoru saptama seyreltilir.
10. her çukuruna ikincil antikor seyreltilmiş 50 ul ekle ile karıştırınÇok kanallı bir pipet.
11. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
12. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
13. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
14. her 50 ul muhabiri de ekleyin ve çok kanallı pipet ile karıştırın.
15. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
16. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı ²⁹ ile 50 ul analiz eder.
    Not: çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) birimleri cinsinden ölçülür. Her zaman ifadeYazılım kılavuzun en son sürümü, varsa hataları önlemek için.

Sonuçlar

Bir benzersiz Boncuk değişkenlik örnek için spesifik olmayan bağlanma ölçmek ve kontrol numunesi olarak kullanılmıştır. Bu boncuklar da birleştirme aşamasında herhangi bir antijen ile inkübe değil haricinde antijene bağlanmış boncuklara benzer şekilde muamele edilmiştir. ayrıca serumdan şüpheli kirlenme nedeniyle analizleri ve kalan yanıtlar dağıtılan log edildi tüm tükürük örnekleri ile inkübe kontrol boncuk elde edilen MFI değerleri> 500 çıkarıl...

Tartışmalar

Bu sonuçlar, çok katlı bir bağışıklık deneyi, immünopozitif ya immunonegative olan tükürük örnekleri arasında ayrım için yararlı olduğunu göstermektedir. immunopozitivitesi belirlemek için, tek bir kesim noktası ortalama artı tükürük örneklerinin her test kontrol Kuplajsız boncuk log dönüştürülmüş MFI yanıtları üç standart sapma hesaplanırken tarafından geliştirilmiştir. kesim noktası, ya bir tek ya da çok patojenlere maruz kalma ve immunoprevalence değerlendirme yeteneği el...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Used to centrifuge samples
Vortex Mixer	VWR	G560	Used to mix samples
Sonicator (mini)	Fisher Scientific	15-337-22	Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	Various
Hemacytometer (Bright Line)	Housser Scientific	3200	Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold	Millipore	MSVMHTS00	Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker	VWR	12620-926	Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)	VWR	30128-346
Weighing Scale	Mettler or other		Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer	Invitrogen	947-01	Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software	Luminex Corporation	LX200-XPON3.1	Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture	Meridian Life Sciences	8505	Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate	Meridian Life Sciences	R14101	Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)	Meridian Life Sciences	R18426	Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells	KPL	50-92-93	Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus	(CCHMC)*	NA	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species	KPL	01-92-93	Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	KPL	176-1506	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)	KPL	16-10-02	Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills	BioVentures	5030050C
200 µL pipette tip refills	BioVentures	5030080C
1000 µL pipette tip refills	BioVentures	5130140C
Aluminum foil	Various Vendors		Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates	VWR	40002-009	Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates	Millipore	MABVN1250	Used to run assays
Oracol saliva collection system	Malvern Medical Developments Limited		Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)	Luminex Corporation	Dependent on bead set	Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	Pierce	77149 or 22980	Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Pierce	24510	Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)	Molecular Probes	S-866	Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	M-2933	Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	Sigma	P-9416	Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	Sigma	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**	Sigma	S-8032	**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)	Sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	Sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN