Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Resumen

La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.

Introducción

Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes.

La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 </ Sup>. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18.

Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.

Protocolo

Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas natación. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado y fueron instruidos en el uso del dispositivo de recogida de saliva por la USEPA contratistas capacitados. Las muestras de saliva fueron enviadas en hielo y, a la recepción, se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C como se describe 4.

1. La activación del grano

  1. Volver a suspender las poblaciones conjunto de microesferas por agitación y sonicación durante 20 segundos y la transferencia de aproximadamente 5,0 x 10 6 de las cuentas de valores (400 l) a tubos de microcentrífuga.
    Nota: TLas cuentas se le suministra a una concentración de 12,5 x 10 6 perlas / ml.
  2. Sedimentar las cuentas de valores por centrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas sedimentadas en 100 l de agua destilada (dH2O) por vortex y sonicación durante 20 segundos. Repita el paso 1.2.
  4. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las perlas lavadas en 80 l de fosfato monobásico de sodio 100 mM, pH 6.2 por vortex y sonicación durante 20 seg.
  5. Inmediatamente antes de su uso, hacer una solución de 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mediante la adición de 200 l de dH2O de 10 mg de sulfo-NHS alícuota. Mezclar por vórtice.
  6. Añadir 10 l de la 50 mg / ml de Sulfo-NHS a las perlas. Mezclar por vórtice.
  7. Inmediatamente antes de su uso, hacer una 50 mg / ml de 1-etil-[3dimethylaminopropyl] carbodiimida solución (EDC) mediante la adición de 200 l de agua destilada (dH2O) a la alícuota de 10 mg de EDC. Mezclar por vórtice.
  8. Añadir 10 l de 50solución mg / ml EDC a las perlas. Mezclar por vórtice. Se incuban las perlas durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezcla por vórtice a intervalos de 10 min. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 l de ácido 2- mM 50 [N morfolino] etanosulfónico (MES), pH 5,0 por vortex y sonicación durante 20 seg.
  10. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  11. Repita los pasos 1.9 y 1.10.
    Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con MES 50 mM, pH 5,0.
  12. Resuspender las perlas en 100 l de MES 50 mM, pH 5.0 por vortex y sonicación durante 20 seg.

2. El acoplamiento del grano

  1. Pareja los antígenos a los conjuntos de microesferas utilizando las concentraciones mostradas en la Tabla 1.
  2. Añadir cada antígeno a las perlas activadas y llevar el volumen total a 500 l en MES 50 mM, pH 5,0. Mezclar los antígenos de unaperlas d por vórtice.
  3. Incubar los antígenos y los granos para las 2 horas con mezcla por rotación (~ 15 rpm) a temperatura ambiente en la oscuridad. Sedimentar las perlas acopladas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) -bovine albúmina de suero (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sodio al azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vortex y sonicación. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min y separar el sobrenadante.
    Precaución: La azida de sodio es un producto químico muy tóxico. Es fatal si se ingiere o entra en contacto con la piel. No respirar el polvo / el humo / el gas / la niebla / los vapores o el aerosol. Use equipo de protección personal adecuado (PPE) al manipular y desechar de acuerdo con las leyes apropiadas.
  5. Resuspender las perlas en 1 ml de PBS-TBN por vortex y sonicación durante 20 seg.
  6. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  7. Repita los pasos 2.5 y 2.6.
    Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con PBS-TBN.
  8. Resuspender las perlas acopladas y se lavaron en 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Almacenar las perlas acopladas en un refrigerador C 2-8 ° en la oscuridad.

3. Contador del grano

  1. Preparar una dilución 1:10 de las perlas acopladas en agua o tampón PBS.
  2. Carga de 10 l de la dilución de la gota sobre un hemocitómetro en el punto de introducción de la muestra.
  3. Contar las perlas visto en uno de los 4 x 4 rejillas de esquina. Calcular el número total de perlas acoplaron usando la siguiente fórmula: Count (1 esquina de 4 x 4 grid) x (1 x 10 4) x (factor de dilución) x resuspensión volumen en ml.

4. Confirmación de antígeno de acoplamiento

  1. Resuspender la mezcla social de perlas acopladas a antígenos de interés por vortex y sonicación durante 20 seg.
  2. Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una finalconcentración de 100 cuentas / l de cada perla única establecido en tampón de PBS-1% de BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
  3. Preparar al menos 7 dos veces diluciones en serie de IgG anti-especie de anticuerpo primario de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en placa de 96 pocillos de fondo redondo con tampón de PBS-1% BSA.
  4. Pre-humedecer una columna de 8 pocillos separada (8 filas) de una placa de fondo de filtro de 96 pocillos para cada antígeno prueba de confirmación de acoplamiento con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Añadir 50 l de mezcla de glóbulos de trabajo (perlas de antígenos acoplados a) a los pocillos pre-mojado.
  5. Añadir 50 l de diluciones de anticuerpos a las filas 1-7 de cada columna de la placa de filtro de 96 pocillos y 50 l de tampón BSA PBS-1% a la fila 8, en lugar de anticuerpo diluido para servir como pozos de fondo. Mezclar con una pipeta multicanal pipeteando arriba y abajo 5 veces. Realice el mismo procedimiento para cada conjunto de microesferas antígeno acoplado a confirmarse.
  6. Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambienteratura durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío.
  7. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repita 1x. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  8. Diluir con biotina anti-especie anticuerpo de detección secundario IgG específica de 16 g / ml en PBS-1% BSA.
  9. Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo pipeteando arriba y abajo 5 veces.
  10. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  11. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  12. Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
  13. Añadir 50 l de reportero a cada pocillo y mezclar pipeteando arriba y abajo 5 veces.
  14. dosobre la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  15. Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
    Nota: Los resultados del inmunoensayo multiplex basado en perlas se miden en la intensidad de fluorescencia media (MFI). Consulte siempre a la última versión del manual de software, si está disponible para evitar errores.

5. salival Multiplex Inmunoensayo

  1. Retire la saliva del congelador a -80ºC y permitir que se descongele a temperatura ambiente.
  2. Resuspender el antígeno acoplado stocks de talón por vortex y sonicación durante 20 seg.
  3. Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una concentración final de 100 granos / l de cada conjunto de microesferas único en PBS-BSA 1% de tampón.
  4. Preparar una dilución 1: 4 de saliva wITH tampón PBS-BSA al 1% en un 96 pocillos, placa de pozo profundo.
  5. placa de filtro pre-mojado con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío.
  6. Añadir 50 l de una mezcla de glóbulos de trabajo y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de las placas de filtro de 96 pocillos para un 1: dilución final 8. Mezclar reacciones con una pipeta multicanal. Para el control del pozo, se añaden 50 perlas de antígenos acoplados a más 50 l l de PBS-1% de BSA (tampón como un sustituto de la saliva).
  7. Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  8. perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  9. Diluir anti-humano IgG anticuerpo de detección secundario de cabra biotinilado a 16 g / ml en PBS-1% BSA.
  10. Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo y mezclar el contenido conuna pipeta multicanal.
  11. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  12. perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  13. Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
  14. Añadir reportero 50 l a cada pocillo y mezclar con una pipeta multicanal.
  15. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  16. Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
    Nota: Los resultados del inmunoensayo múltiplex se miden en unidades de mediana intensidad de fluorescencia (IMF). Siempre consultela última versión del manual de software, si está disponible, para evitar errores.

Resultados

Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI> 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación ...

Discusión

Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o mú...

Divulgaciones

La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo de financiar y gestionar la investigación descrita aquí. Ha sido sometido a revisión administrativa del Organismo y aprobado para su publicación. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye una aprobación o recomendación para su uso.

Agradecimientos

Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Software
MicrocentrifugeThermo Electron Corporation75002446Used to centrifuge samples
Vortex MixerVWRG560Used to mix samples
Sonicator (mini)Fisher Scientific15-337-22Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.CappVarious
Hemacytometer (Bright Line)Housser Scientific 3200Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum ManifoldMilliporeMSVMHTS00Used in washing steps to remove supernatant
MicroShakerVWR12620-926Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)VWR30128-346
Weighing ScaleMettler or otherUsed to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample MixerInvitrogen947-01Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)The MathWorks, Inc.Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationUsed to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 softwareLuminex CorporationLX200-XPON3.1Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particleXi Jiang (CCHMC)*NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell cultureMeridian Life Sciences8505Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysateMeridian Life SciencesR14101Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)Meridian Life SciencesR18426Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cellsKPL50-92-93Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus(CCHMC)*NAUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgGMeridian Life SciencesC65885MUsed for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pyloriKPL01-93-94Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondiiAbcamAb23507Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter speciesKPL01-92-93Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson705-065-149Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)KPL16-13-06Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)KPL16-18-06Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)KPL176-1506Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) KPL16-10-02Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubesUSA Scientific1415-2500Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refillsBioVentures5030050C
200 µL pipette tip refillsBioVentures5030080C
1000 µL pipette tip refillsBioVentures5130140C
Aluminum foilVarious VendorsUsed keep beads in the dark during incubations
Deep Well platesVWR40002-009Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter PlatesMilliporeMABVN1250Used to run assays
Oracol saliva collection systemMalvern Medical Developments LimitedUsed for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)Luminex CorporationDependent on bead setAntigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)Pierce77149 or 22980Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)Pierce24510Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)Molecular ProbesS-866Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaM-2933Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)SigmaP-9416Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSASigmaA-78880.1% (w/v)
Tween-20SigmaP-94160.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**SigmaS-8032**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)SigmaS-31390.1M NaH2PO4
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

Referencias

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Inmunolog aNo 115Multiplexinmunoensayoanticuerpos salivalesla salivala exposici nla multiplexaci n basada en perlasmicroesferas carboxiladasacoplamiento del granola confirmaci n de acoplamiento

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados