O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

Resumo

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Resumo

A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.

Introdução

Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças ^1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas ^2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a exposição humana para estes agentes patogénicos e para melhor definir e infecções immunoprevalence incidentes.

Saliva é uma promessa considerável como uma alternativa ao soro para pesquisa com biomarcadores humano. Entre as vantagens da utilização de saliva são os não-invasivo e facilidade de recolha de amostras, de baixo custo, e as amostras podem ser facilmente obtidas de crianças ^{5-7 <}/ Sup>. As amostras de soro e saliva foram estudados extensivamente para anticorpos contra H. pylori ^2,3,8, Plasmodium falciparum ^9, Entamoeba histolytica ^10, Cryptosporidium parvum ^3,11, Streptococcus pneumonia ^12, vírus da hepatite A e C ^13-14, noroviruses ^2-4,15, T. gondii ^2-4, vírus da dengue ^16, o vírus da imunodeficiência humana (VIH) ^17, e Escherichia coli O157: H7 ^18.

Um imunoensaio em multiplex permite a análise de múltiplos analitos em simultâneo dentro de um único volume de amostra e dentro de um único ciclo ou correr. Antígenos multiplexados de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, vírus da hepatite A, e duas noroviruses foram usadas para medir humano IgG salivar ^4/2 e IgA IgG no plasma ^3,4 e ^2,3 respostas de anticorpos para estes agentes patogénicos usando um-Grânulo baseado imunoensaio multiplexação. Quando usado em conjunto com estudos epidemiológicos de exposição a micróbios em água, solo e dos alimentos, do tipo de ensaio descrito neste estudo pode fornecer informação valiosa para melhorar a compreensão de infecções causadas por agentes patogénicos ambientais. Além disso, os dados obtidos a partir de anticorpos salivares tais estudos pode ser usada para melhorar os modelos de avaliação do risco ^19-22.

Protocolo

A aprovação foi obtida a partir do Institutional Review Board (IRB # 08-1844, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) para a recolha de amostras de saliva crevicular estimulados de banhistas em Boquerón Beach, Puerto Rico, como parte dos Estados Unidos Environmental Protection Agency (EPA) epidemiológica Nacional e Avaliação ambiental de recreio (neear) Estudo de água ²³ para avaliar as exposições e doenças de natação associado. Os sujeitos do estudo forneceu consentimento informado e foram instruídos sobre o uso do dispositivo de recolha de saliva por empreiteiros USEPA treinados. As amostras de saliva foram enviadas em gelo e, após a recepção, eles foram centrifugadas e armazenadas a -80 ° C como descrito ^4.

1. A activação do grânulo

1. Conjunto de esferas stocks Ressuspender por vórtex e ultrassons durante 20 segundos e transferência de aproximadamente 5,0 x 10 ⁶ dos grânulos Stock (400 ul) a tubos de microcentrífuga.
   Nota: Tele grânulos são fornecidos a uma concentração de 12,5 x 10 ⁶ contas / ml.
2. Sedimentar as pérolas de banco por centrifugação a 10000 xg durante 2 min.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas peletizadas em 100 ul de água destilada _(dH2O) por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. Repita o passo 1.2.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender as esferas lavadas em 80 ul de 100 mM de fosfato de sódio monobásico, pH 6,2 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
5. Imediatamente antes da utilização, fazer uma solução 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) por adição de 200 uL _{de dH2O} de 10 mg, Sulfo-NHS alíquota. Misture por vórtice.
6. Adicionar 10 ul de 50 mg / ml de sulfo-NHS para os grânulos. Misture por vórtice.
7. Imediatamente antes da utilização, fazer uma de 50 mg / mL de 1-etil- [3dimethylaminopropyl] carbodiimida solução (EDC) de cloridrato por adição de 200 ul de água destilada _(dH2O) para os 10 mg de EDC alíquota. Misture por vórtice.
8. Adicionar 10 ul de 50mg / ml solução EDC para os grânulos. Misture por vórtice. Incubar as contas durante 20 min à temperatura ambiente, no escuro, com agitação por vortex em intervalos de 10 min. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
9. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 250 ul de ácido 2- 50 mM de [N-morfolino] etanossulfónico (MES), pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
10. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
11. Repita os passos 1.9 e 1.10.
    Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com 50 mM de MES, pH 5,0.
12. Ressuspender as pérolas em 100 ul de 50 mM de MES, pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.

2. Bead Coupling

1. Par os antigénios para os conjuntos de esferas usando as concentrações apresentadas na Tabela 1.
2. Adicionar cada antigénio para as esferas activadas e levar o volume total a 500 mL em MES 50 mM, pH 5,0. Misturar os antigénios umd grânulos por vortex.
3. Incubar os antigénios e os grânulos durante 2 horas, com mistura por rotação (~ 15 rpm) à temperatura ambiente no escuro. Agregar as esferas acopladas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 500 ul de salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro -bovine (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sódio a azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vórtice e sonicação. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante.
   Cuidado: A azida de sódio é um produto químico altamente tóxico. É fatal se ingerido ou entra em contato com a pele. Não respirar as poeiras / fumos / gases / névoas / vapores ou spray. Use equipamento de proteção pessoal adequado (do PPE) ao manusear e descartar de acordo com as leis apropriadas.
5. Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS-TBN por vórtice e ultra-sons durante 20 seg.
6. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min.
7. Repita os passos 2.5 e 2.6.
   Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com PBS-TBN.
8. Ressuspender as esferas acopladas e lavadas em 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Armazenar as esferas acopladas num refrigerador entre 2-8 ° C no escuro.

3. Contagem Bead

1. Prepara-se uma diluição das pérolas acopladas em água ou tampão PBS 1:10.
2. Carga de 10 ul da diluição o grânulo em um hemocitómetro no ponto de introdução da amostra.
3. Contar as esferas visto em um dos 4 x 4 grelhas de canto. Calcular o número total de pérolas acoplado usando a seguinte fórmula: Contagem (uma esquina da grade 4 x 4) x (1 x 10 ⁴⁾ x (factor de diluição) x volume de ressuspensão em ml.

4. Confirmação do Antigen Coupling

1. Ressuspender a mistura estoque de esferas acopladas a antígenos de interesse pelo vórtice e sonicação por 20 s.
2. Prepare uma mistura de pérolas para trabalhar diluindo os estoques talão acoplados a uma finalconcentração de 100 esferas / mL de cada grânulo único situado em tampão PBS-BSA a 1% (PBS-BSA a 1%, pH 7,4).
3. Preparar pelo menos duas 7 diluições em série de anti-IgG de espécies de anticorpo primário de acordo com as recomendações do fabricante em placa de 96 poços de fundo redondo com tampão PBS-BSA a 1%.
4. Pré-molhou uma coluna de oito poços separada (8 linhas) de uma placa de fundo de filtro de 96 poços para cada teste de confirmação de ligação de antigénio com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 50 ul de mistura de pérolas para trabalhar (grânulos acoplado-antigénio) aos poços pré-molhado.
5. Adicionar 50 ul de diluições de anticorpos de linhas 1-7 de cada coluna da placa de filtro de 96 poços e 50 ul de tampão BSA a 1%, PBS a linha 8 no lugar de anticorpo diluído para servir como poços de fundo. Misture com uma pipeta multi-canal pipetando cima e para baixo 5 vezes. Execute o mesmo procedimento para cada conjunto de esferas acopladas-antigénio a ser confirmada.
6. Tampa e deixa-se incubar no escuro à tempratura durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração.
7. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repetir 1x. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
8. Diluir biotinilados anti-espécies anticorpo de detecção secundário IgG específica para 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
9. Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído a cada poço, pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
10. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
11. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
12. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
13. Adicionar 50 ul de repórter para cada poço e misture pipetando cima e para baixo 5 vezes.
14. Csobre a placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
15. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador ^29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex com base em grânulo são medidas de intensidade de fluorescência média (IFM). Sempre consulte a versão mais recente do manual do software, se disponível para evitar erros.

5. salivar Multiplex Immunoassay

1. Remover saliva da -80 ° C congelador e deixa-se descongelar à temperatura ambiente.
2. antígeno Ressuspenda acoplado stocks talão por vórtice e sonicação por 20 s.
3. Prepara-se uma mistura de pérolas de trabalho por diluição das existências grânulo acoplados a uma concentração final de 100 esferas / mL de cada conjunto de esferas original em PBS-1% de BSA tampão.
4. Prepara-se uma diluição de 1: 4 de saliva Wom PBS-1 de tampão BSA% em um 96 bem, placa poço profundo.
5. placa de filtro pré-molhado com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração.
6. Adicionar 50 ul de uma mistura de pérolas de trabalho e um volume igual de saliva diluída a 95 poços das placas de filtro de 96 poços para uma diluição de 1: 8 definitiva. Misture reacções com uma pipeta multi-canal. Para o controlo de uma cavidade, adicionar 50 grânulos acoplado-antigénio ul, mais 50 ul de PBS-1% BSA (tampão como um substituto para a saliva).
7. Tampa e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
8. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
9. Dilui-se o anticorpo de detecção secundário anti-IgG humano de cabra biotinilado a 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
10. Adicionar 50 ul de anticorpo secundário diluído a cada poço e misturar o conteúdo comuma pipeta multi-canal.
11. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
12. grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal.
13. Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%.
14. Adicionar 50 ul repórter a cada poço e misture com uma pipeta multi-canal.
15. Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x.
16. Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador ^29.
    Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex são medidos em unidades Mediana intensidade de fluorescência (MFI). Consulte sempre oa versão mais recente do manual de software, se disponível para evitar erros.

Resultados

Um conjunto de esferas original foi utilizado como um controlo para medir a ligação não específica e amostra para amostra variabilidade. Estas esferas foram tratadas de forma idêntica ao antigénio esferas acopladas com a excepção de que não foram incubadas com qualquer antigénio no passo de acoplamento. IFM valores> 500 obtidos a partir das esferas de controlo incubadas com todas as amostras de saliva foram retirados da análise ainda mais devido à suspeita de contaminaçã...

Discussão

Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vár...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge	Thermo Electron Corporation	75002446	Used to centrifuge samples
Vortex Mixer	VWR	G560	Used to mix samples
Sonicator (mini)	Fisher Scientific	15-337-22	Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	Various
Hemacytometer (Bright Line)	Housser Scientific	3200	Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold	Millipore	MSVMHTS00	Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker	VWR	12620-926	Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted)	VWR	30128-346
Weighing Scale	Mettler or other		Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer	Invitrogen	947-01	Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b)	The MathWorks, Inc.		Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014	Microsoft Corporation		Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software	Luminex Corporation	LX200-XPON3.1	Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particle	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	*Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture	Meridian Life Sciences	8505	Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori : lysate	Meridian Life Sciences	R14101	Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1)	Meridian Life Sciences	R18426	Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni : heat killed whole cells	KPL	50-92-93	Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus	(CCHMC)*	NA	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG	Meridian Life Sciences	C65885M	Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species	KPL	01-92-93	Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L)	KPL	16-13-06	Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L)	KPL	16-18-06	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L)	KPL	176-1506	Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ)	KPL	16-10-02	Used for Salivary Immunoassay
Consumables
1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes	USA Scientific	1415-2500	Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µL pipette tip refills	BioVentures	5030050C
200 µL pipette tip refills	BioVentures	5030080C
1000 µL pipette tip refills	BioVentures	5130140C
Aluminum foil	Various Vendors		Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates	VWR	40002-009	Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates	Millipore	MABVN1250	Used to run assays
Oracol saliva collection system	Malvern Medical Developments Limited		Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads)	Luminex Corporation	Dependent on bead set	Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)	Pierce	77149 or 22980	Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Pierce	24510	Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL)	Molecular Probes	S-866	Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	M-2933	Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)	Sigma	P-9416	Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)**			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA	Sigma	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20	Sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)**	Sigma	S-8032	**Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)	Sigma	S-3139
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filter Sterilize and store at 4°C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous)	Sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	Fisher	SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			Filter Sterilize and store at 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	Sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN