تسليم داخل الأوعية الدموية من البيولوجيات إلى الكلى الجرذ

Summary

إدارة المخدرات لاستعادة وظيفة الكلى تتطلب السيطرة على توطين وتوزيع مركب العلاجي. هنا، نحن تصف بالتفصيل تقنية بسيطة للتسليم ضمن الكلية المخدرات في الفئران. هذا الإجراء يمكن أداؤها بسهولة مع أي وفيات واستنساخ عالية.

Abstract

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Introduction

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت التجارب على الفئران الإناث سبراغ داولي، وزنها 250-300 غرام. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية تمتثل للمعايير المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد الثروة الحيوانية مختبر، والأكاديمية الوطنية للعلوم في بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) والتي بمستشفى مايو كلينيك بكلية الطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. إعداد

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة. إذا تم التخطيط جراحات متعددة على الفئران مختلفة في نفس اليوم، وشطف الأدوات بعد كل إجراء الحيوان ومن ثم تعقيم باستخدام معقم حبة ساخنة.
2. تخدير الفئران مع 4٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة O _2.
3. نقل الفئران على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. الحفاظ على التخدير مع 1-2٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة O _2.
4. إدارة المخدرات مسكن (البوبرينورفين المستدام الإصدار 0.6 ملغ / كلغ) سوbcutaneously.
5. تطبيق مرهم للعين لمنع جفاف أثناء العملية.
6. من أجل التعويض عن فقدان سوائل الجسم بسبب البطن، فمن المهم لإدارة 10 مل / كغ من 0.9٪ محلول ملحي تحت الجلد قبل الجراحة.
7. حلق منطقة البطن وتنظيف البشرة مع منصات الإيثانول اليود بوفيدون و 70٪.

2. إجراء العمليات الجراحية

1. تأكد من أن عمق التخدير كاف من خلال مراقبة ردود الفعل الجسدية، مثل الانسحاب من قرصة اصبع القدم، منعكس الجفن، لهجة الفك، والتنفس معدل / النمط.
2. إجراء عملية فتح البطن من خلال شق خط الوسط صغيرة (2-2.5 سم في الطول) باستخدام شفرة المشرط الجراحي رقم 10.
3. سحب الأمعاء والقولون إلى الجانب الأيمن من البطن باستخدام قطعة قطن وتغطيتها بشاش معقم غارقة في لمحلول ملحي 0.9٪ للحفاظ على أجهزة رطبة.
4. سحب بلطف صعودا والطحال والكبد والمعدة والبنكرياس لفضح منطقة المسؤوليةتا والشريان الكلوي الأيسر.
5. بمساعدة الميكروسكوب الجراحي، بعناية فصل الشريان الأورطي البطني فوق وتحت الكلية اليسرى والشريان الكلوي الأيسر من الأوردة، والدهون والأنسجة المحيطة الضام مع تشريح منحني الملقط حادة وقطعة قطن معقمة.
   1. استخدام ملقط مع حركة (تشريح حادة) المتكررة مفتوحة قريبة على طول الأوعية لإزالة الأنسجة الضامة ومسحات القطن مع تحريك المتداول الجانبية لإزالة الدهون.
      ملاحظة: تشريح المنطقة شبه الأبهري هي خطوة حساسة جدا كما الأعصاب والأوعية اللمفاوية قد يكون معطوبا. تأكد من أن تبقي الشرايين رطبة مع المياه المالحة أثناء إجراء تشريح.
6. وضع خياطة 4-0 الحرير تحت الشريان الأورطي.
7. باستخدام لقطات الاوعية الدموية الدقيقة، المشبك الأبهر فوق (أقل بقليل من الشريان المساريقي العلوي) ودون التشعب الشريان الكلوي.
8. ثقب الشريان الأورطي في مستوى kidn الأيسرالتشعب الشريان EY مع 24 G قسطرة وريدية وتقدم قسطرة في الشريان الكلوي.
   ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة كما ثقب من خلال الشريان الكلوي قد يحدث.
9. توصيل حقنة مليئة محلول الدواء أو المالحة (ما يصل الى 500 ميكرولتر) إلى القسطرة ويروي الكلى.
10. مباشرة بعد نضح، المشبك الوريد الكلوي الأيسر والحالب الأيسر مع مقطع الاوعية الدموية الدقيقة وإزالة القسطرة. ثم، ضع قطعة من امتصاص الاسفنجة مرقئ الجيلاتين، مع انخفاض طفيف لاصقة الأنسجة، وعلى المنطقة مثقوب يحتوى من الشريان الأورطي وتطبيق الضغط بلطف مع مسحة القطن.
11. في نفس الوقت، والإفراج عن المشبك من الشريان الأورطي البطني، دون التشعب الشريان الكلوي الأيسر. بعد 5 دقائق، والإفراج عن المشبك من الوريد الكلوي والحالب.
12. بعناية الافراج عن المشبك من الشريان الأورطي، فوق التشعب الشريان الكلوي الأيسر، والسماح لضخه في الكلى. مجموع نقص تروية الكلى يجب أن يستمر لا تزيد عن 7 دقائق.
تأكد من عدم وجود نزيف يحدث ومراقبة الوضع عن كثب لمدة 10 دقيقة أكثر.
13. إغلاق شق البطن في طبقتين (العضلات والجلد)، وذلك باستخدام 4-0 الغرز للامتصاص ونمط مستمر لمنع العدوى. بالإضافة إلى تقنية خياطة نمط مستمر، وثمة خيار آخر يتمثل في استخدام بسيطة، تقنية انقطاع، وخاصة بالنسبة للجسم إغلاق الجدار لمنع تفزر.
14. تطبيق مرهم مضاد حيوي موضعي على منطقة شق لمنع العدوى.
15. نقل الفئران في قفص المراقبة خالية من الفراش على وسادة دافئة حتى الشفاء الكامل مع درجة حرارة تتراوح ضعت في 35-37 درجة مئوية. يجب تغطية الفراش فضفاضة (على سبيل المثال مع ثنى أو منشفة ورقية) أو إزالتها من القفص حتى يتم استرداد الحيوانات بشكل كامل لمنع الاختناق أو طموح الفراش.
16. بعد الجراحة، ومراقبة الحيوانات باستمرار حتى التنفس من تلقاء أنفسهم، ثم كل ساعة لبضع ساعات. إعادة جرعة مسكن البوبرينورفين ريال 72 ساعةفي وقت لاحق إذا لاحظت علامات الانزعاج، مثل الخمول، منحنية وضيع، كشر، عدم استئناف الأنشطة العادية.
17. بعد الانتهاء من جميع الدراسات والموت ببطء الحيوانات مع استنشاق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون ₂ وحصاد أنسجة الكلى للخارج الحي تحلل مثل الأنسجة والغربية التنشيف ^5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نحن حقن جرعتين مختلفة من عامل نمو بطانة الاوعية المؤتلف الفئران (rrVEGF، 0.17 ميكروغرام / كغ و 5 ميكروغرام / كغ) أو برنامج تلفزيوني. الموت الرحيم كانت الحيوانات 8 ساعات بعد عملية جراحية لدراسة تفعيل المسار VEGF. وقال إن العملية الجراحية لن يؤثر على التشكل ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370