Die intravaskuläre Lieferung von Biologics zur Rattenniere

Zusammenfassung

Die Verabreichung von Medikamenten für die Wiederherstellung der Nierenfunktion erfordert die Kontrolle der Lokalisierung und Verteilung der therapeutischen Verbindung. Hier beschreiben wir im Detail eine einfache Technik für intrarenalen Abgabe von Arzneimitteln in Ratten. Dieses Verfahren kann ohne Mortalität und hoher Reproduzierbarkeit leicht durchgeführt werden.

Zusammenfassung

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Einleitung

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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Protokoll

Die Versuche wurden an weiblichen Sprague-Dawley Ratten, mit einem Gewicht von 250-300 g. Alle Tierverfahren mit den Normen im Leitfaden angegebenen halten für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortier Ressourcen, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) und wurden von der Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care genehmigt und Use Committee (IACUC).

1. Vorbereitung

1. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Wenn mehrere Operationen auf verschiedenen Ratten am selben Tag geplant sind, spülen Instrumente nach jedem Tier Verfahren und dann sterilisieren eine heiße Perle Sterilisator verwenden.
2. Anästhesieren die Ratte mit 4% Isofluran in 1 l / min O _2.
3. Übertragung der Ratte zu einer kontrollierten Heizkissen die Körpertemperatur bei 37 ° C zu bewahren. Aufrechterhaltung einer Anästhesie mit 1-2% Isofluran in 1 l / min O _2.
4. Verwalten des Analgetikum (Buprenorphin Retard 0,6 mg / kg) subcutaneously.
5. Anwenden Salbe auf die Augen Trocknen während des Verfahrens zu verhindern.
6. Um den Verlust von Körperflüssigkeiten aufgrund Laparotomie zu kompensieren, ist es wichtig, 10 ml / kg 0,9% normale Kochsalzlösung subkutan präoperativ zu verabreichen.
7. Rasieren Sie den Bauchbereich und reinigen Sie die Haut mit PVP-Jod und 70% Ethanol-Pads.

2. Chirurgisches Verfahren

1. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Sedierung durch die Überwachung der körperlichen Reflexe angemessen ist, wie Rückzug aus dem Zeh Prise, Augenlidreflexe, Kiefer- Ton und Atemfrequenz / Muster.
2. Durchführen einer Laparotomie durch einen kleinen Mittellinienschnitt (2-2,5 cm in der Länge), ein chirurgisches Skalpell-Klinge No. unter Verwendung von 10.
3. Ziehen Sie den Darm und Doppelpunkt an der rechten Seite des Bauches von Wattestäbchen und bedecken sie mit steriler Gaze getränkt in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung die Organe feucht zu halten.
4. einfahren vorsichtig nach oben, die Milz, Leber, Magen und Bauchspeicheldrüse die AOR aussetzenta und die linke Nierenarterie.
5. Mit Hilfe eines Operationsmikroskops, trennen Sie vorsichtig die Bauchaorta oberhalb und unterhalb der linken Niere und der linken Nierenarterie aus den Venen, das Fett und das umgebende Bindegewebe mit stumpfen Sezieren einer gebogenen Pinzette und sterile Wattestäbchen.
   1. Verwenden Sie die Zange mit einer wiederholten Öffnungs- und Schließbewegung (stumpf) entlang der Länge der Schiffe das Bindegewebe und die Wattestäbchen mit einer seitlichen Rollbewegung zu entfernen, um das Fett zu entfernen.
      HINWEIS: Die Präparation der peri-Aorten-Region ist eine sehr heikle Schritt wie Nerven und Lymphgefäße beschädigt werden könnte. Achten Sie darauf, die Arterien feucht mit Kochsalzlösung während der Präparation Verfahren zu halten.
6. Legen Sie eine 4-0 Seidennaht unter der Aorta.
7. Mit mikrovaskulären Clips, klemmen die oben Aorta (knapp unterhalb der A. mesenterica superior) und unterhalb der Nierenarterie Bifurkation.
8. Die Punktion der Aorta auf Höhe des linken kidney Arterie Gabelung mit 24 G intravenösen Katheter und den Katheter in die Nierenarterie gelangen.
   ANMERKUNG: Dies ist ein kritischer Schritt, da Punktion durch die Nierenarterie auftreten.
9. Eine Spritze mit der Medikamentenlösung oder Kochsalzlösung gefüllt (bis zu 500 & mgr; l) zu dem Katheter und der Niere perfundiert.
10. Unmittelbar nach der Perfusion, klemmen die linke Nierenvene und die linke Harnleiter mit einem mikrovaskulären Clip und den Katheter zu entfernen. Dann legen Sie ein Stück resorbierbaren hemostat Gelatineschwamm, mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber über den punktierten Bereich der Aorta und sanft anwenden Druck mit einem Wattestäbchen.
11. Zur gleichen Zeit, lassen Sie die Klammer aus der abdominalen Aorta, unterhalb der linken Nierenarterie Bifurkation. Nach 5 Minuten, lassen Sie die Klemme aus Nierenvene und Harnleiter.
12. vorsichtig loslassen Klemme aus der Aorta, über der linken Gabelung Nierenarterie und für Nieren Reperfusion zu ermöglichen. Die Gesamt sollte renale Ischämie dauern nicht länger als 7 min.
13. Stellen Sie sicher, dass keine aktive Blutung auftritt und genau den Bereich für 10 weitere Minuten beobachten.
14. Schließen der Bauchschnitt in zwei Schichten (Muskel und Haut), unter Verwendung von 4-0 resorbierbaren Fäden und ein kontinuierliches Muster Infektion zu verhindern. Neben dem kontinuierlichen Muster Nahttechnik, wäre eine andere Möglichkeit, eine einfache, unterbrochen Technik zu verwenden, insbesondere für die Körperwand Verschluss Dehiszenz zu verhindern.
15. Anwenden topischen antibiotischen Salbe auf den Schnittbereich Infektionen zu verhindern.
16. Übertragen Sie die Ratte in eine Einbettung freie Beobachtungskabine an einem warmen Kissen bis zur vollständigen Wiederherstellung mit einem Temperaturbereich eingestellt bei 35-37 ° C. Lose Bettwäsche sollte (zB mit einem Tuch oder einem Papiertuch) oder entfernt aus dem Käfig abgedeckt werden , bis Tiere vollständig wiederhergestellt werden Erstickung oder Aspiration von Betten zu verhindern.
17. Nach der Operation beobachten die Tiere kontinuierlich, bis spontan atmenden, dann stündlich für ein paar Stunden. Re-Dosis das Analgetikum Buprenorphin SR 72 Stundenspäter, wenn Anzeichen von Beschwerden beobachtet werden, wie Lethargie, krumm und vergammelt, Grimasse, nicht normalen Aktivitäten wieder aufnehmen.
18. Nach Abschluss aller Studien, einschläfern Tiere mit dem Einatmen von einer Überdosis von CO ₂ und ernten die Nierengewebe für ex vivo - Analysen wie Histologie und Western Blotting ^5.

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Ergebnisse

Wir injizierten zwei verschiedenen Dosen von rekombinantem Ratten-VEGF (rrVEGF, 0,17 & mgr; g / kg und 5 & mgr; g / kg) oder PBS. Die Tiere wurden 8 Stunden nach der Operation eingeschläfert die Aktivierung des VEGF-Weg zu untersuchen. Das chirurgische Verfahren beeinflusste nicht die Morphologie der perfundierte Niere (1A) , wenn der Steuerung (1B) verglichen wird , wie durch H & E - Färbung gezeigt. Während Sirius - Rot - Färbung ...

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Diskussion

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370