ラット腎臓への生物製剤の血管内デリバリー

要約

腎機能の回復のための薬剤の投与は、治療化合物の局在化および分布の制御を必要とします。ここでは、具体的にラットにおける薬物の腎内送達のための簡単​​な方法を説明します。この手順は容易に死亡し、再現性良く行うことができます。

要約

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

概要

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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プロトコル

実験は250〜300グラムの重量を量る、雌性Sprague-Dawleyラットで実施しました。実験動物の管理と使用に関するガイドに記載された基準に準拠し、すべての動物の手順は、（実験動物資源、全米科学アカデミーの研究所、ベセスダ、MD、USA）とは、医療施設内動物管理のメイヨークリニックの大学によって承認されました使用委員会（IACUC）。

1.準備

1. 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブ。別のラットに複数の手術を同じ日に予定されている場合は、それぞれの動物の処置後の器具を洗浄した後、ホットビーズ滅菌器を使用して滅菌します。
2. 1リットル/分のO ₂の4％イソフルランでラットを麻酔。
3. 37℃の体温を維持するために制御された加熱パッドにラットを転送します。 1リットル/分のO ₂中で1〜2％イソフルランで麻酔を維持します。
4. 鎮痛薬（ブプレノルフィンは、リリース0.6ミリグラム/キログラムを持続）suコマンドを管理しますbcutaneously。
5. 手順の間に乾燥を防ぐために、目に軟膏を適用します。
6. 開腹への体液の損失を補償するために、術前に、0.9％生理食塩水の皮下は10ml / kgで投与することが重要です。
7. 腹部を剃るとポビドンヨードおよび70％エタノールパッドと肌をきれいに。

2.外科的手順

1. 鎮静の深さは、このようなつま先のピンチ、眼瞼反射、顎のトーン、および呼吸速度/パターンからの撤退などの物理的な反射神経を、監視することで十分であることを確認してください。
2. 手術用メスの刃10号を使用して、小さな正中切開（長さ2〜2.5センチメートル）を介して開腹を行います。
3. 綿棒を使って、腹部の右側に腸および結腸を引いて、湿った臓器を維持するために、0.9％の生理食塩水にに浸した滅菌ガーゼでそれらをカバーしています。
4. ゆっくりAORを露出するように上向きに脾臓、肝臓、胃や膵臓を撤回TAと左腎動脈。
5. 手術用顕微鏡の助けを借りて、慎重に上記と左腎臓や静脈、脂肪から左腎動脈と鈍い解剖湾曲鉗子と滅菌綿棒で周囲の結合組織の下に腹部大動脈を分離します。
   1. 脂肪を除去するために、横揺れ運動と結合組織と綿棒を除去するために、血管の長さに沿って繰り返し開閉運動（鈍的切開）とピンセットを使用してください。
      注：周囲大動脈領域の解剖が破損する可能性があります神経やリンパ管のような非常にデリケートなステップです。解剖の手順の間に生理食塩水で湿った動脈を維持することを確認します。
6. 大動脈の下に4-0絹縫合糸を配置します。
7. 微小血管クリップを使用して、（ちょうど上腸間膜動脈の下）と腎動脈分岐部の下に上記の大動脈をクランプします。
8. 左kidnのレベルで大動脈を穿刺24 G静脈内カテーテルとEY動脈分岐部とは、腎動脈にカテーテルを進めます。
   注：これが発生する可能性があり、腎動脈を通る穿刺などの重要なステップです。
9. カテーテルに（500μLまで）薬物溶液または生理食塩水で満たされた注射器を接続し、腎臓を灌流。
10. すぐに灌流した後、微小血管クリップで左腎静脈と左尿管をクランプし、カテーテルを除去します。その後、大動脈のパンクチャー領域にわたって、組織接着剤の小滴で、吸収性止血ゼラチンスポンジのピースを置き、静かに綿棒で圧力をかけます。
11. 同時に、左腎動脈分岐部の下に、腹部大動脈からクランプを解放します。 5分後、腎静脈や尿管からのクランプを解除します。
12. 慎重に左腎動脈分岐部の上に、大動脈からクランプを解放し、腎臓の再灌流を可能にします。総腎虚血はもはや7分以上持続するべきではありません。
13. はアクティブな出血が発生していないことを確認し、密接に10以上の分の領域を観察します。
14. 感染を防ぐために、4-0吸収性縫合糸と連続パターンを使用して、2層（筋肉や皮膚）で腹部切開を閉じます。連続パターン縫合技術に加えて、別のオプションは、裂開を防止するために、特に、体壁の閉鎖のために、単純な遮断技術を使用することであろう。
15. 感染を防ぐために、切開領域にわたって局所抗生物質軟膏を適用します。
16. 35-37℃に設定した温度範囲で完全に回復するまで暖かいパッド上の寝具フリー観察ケージにラットを転送します。ルース寝具はカバーされ（ 例えば 、ドレープや紙タオルで）または動物が完全に窒息や布団の誤嚥を防ぐために回収されるまで、ケージから削除する必要があります。
17. 手術後、数時間毎時その後、自発的に呼吸するまで継続的に動物を観察します。再用量鎮痛剤ブプレノルフィンSR 72時間後に不快感の兆候は、猫背やだらしない無気力、しかめっ面、通常の活動を再開していないとして、認められた場合。
18. すべての研究が完了した後、CO ₂の過剰摂取の吸入で動物を安楽死させると、このような組織学およびウエスタンブロッティング⁵のように分析するex vivoのための腎組織を採取します。

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結果

我々は、組換えラットVEGF（rrVEGF、0.17μgの/キログラムおよび5μg/ kg）またはPBSの二つの異なる投与量を注入しました。動物は、VEGF経路の活性化を調べるために、8時間後に手術を安楽死させました。 H＆E染色によって示されるように、制御（ 図1B）と比較した場合、外科的処置は、灌流腎臓（ 図1A）の形態に影響を及ぼしませんでした。?...

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ディスカッション

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370