Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

Resumen

La administración de fármacos para la recuperación de la función renal requiere el control de la localización y distribución del compuesto terapéutico. A continuación, describimos en detalle una técnica sencilla para la entrega intrarrenal de drogas en ratas. Este procedimiento se puede realizar fácilmente sin mortalidad y alta reproducibilidad.

Resumen

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Introducción

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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Protocolo

Los experimentos se realizaron en ratas hembra Sprague-Dawley, con un peso de 250-300 g. Todos los procedimientos con animales cumplían con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, Academia Nacional de Ciencias, Bethesda, MD, EE.UU.) y fueron aprobados por la Mayo Clinic College de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).

1. Preparación

1. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía. Si se han previsto múltiples cirugías en diferentes ratas en el mismo día, enjuague los instrumentos después de cada procedimiento animal y después esterilizar utilizando un esterilizador de cuentas en caliente.
2. Anestesiar la rata con 4% de isoflurano en 1 L / min O _2.
3. La transferencia de la rata para una resistencia de calentamiento controlado para conservar la temperatura corporal a 37 ° C. Mantener la anestesia con isoflurano 1-2% en 1 L / min O _2.
4. Administrar el fármaco analgésico (buprenorfina liberación sostenida de 0,6 mg / kg) Dobcutaneously.
5. Aplique un ungüento para los ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento.
6. Con el fin de compensar la pérdida de fluidos corporales debido a la laparotomía, es importante para administrar 10 ml / kg de 0,9% por vía subcutánea solución salina normal antes de la operación.
7. Afeitar el área abdominal y limpiar la piel con almohadillas de etanol povidona yodada y el 70%.

2. Procedimiento Quirúrgico

1. Asegúrese de que la profundidad de la sedación es adecuada mediante el control de los reflejos físicos, como la retirada de la pizca dedo del pie, reflejo palpebral, el tono de la mandíbula, y la respiración tasa / patrón.
2. Realizar una laparotomía a través de una pequeña incisión en la línea media (2-2,5 cm de longitud), utilizando una hoja de bisturí quirúrgico Nº 10.
3. Tire del delgado y el colon en el lado derecho del abdomen mediante el uso de bastoncillos de algodón y cubrir con una gasa estéril empapada en solución salina normal al 0,9% para mantener los órganos húmedo.
4. retraer con suavidad hacia arriba el bazo, el hígado, el estómago y el páncreas para exponer el AORta y la arteria renal izquierda.
5. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, separe con cuidado la aorta abdominal por encima y por debajo del riñón izquierdo y la arteria renal izquierda de las venas, la grasa y el tejido conectivo que rodea con unas pinzas de disección romos curvada e hisopos de algodón estériles.
   1. Use las pinzas con un movimiento (disección roma) de apertura y cierre repetidos a lo largo de la longitud de los vasos para extraer el tejido conectivo y los bastoncillos de algodón con un movimiento de balanceo lateral para eliminar la grasa.
      NOTA: La disección de la región peri-aórtica es una etapa muy delicada ya que los nervios y los vasos linfáticos podrían ser dañados. Asegúrese de mantener las arterias húmedo con solución salina durante el procedimiento de disección.
6. Colocar una sutura de seda 4-0 por debajo de la aorta.
7. El uso de clips microvasculares, sujetar la aorta por encima (justo debajo de la arteria mesentérica superior) y por debajo de la bifurcación de la arteria renal.
8. La punción de la aorta a nivel del kidn izquierdabifurcación de la arteria ey con un catéter intravenoso 24 G y avanzar el catéter en la arteria renal.
   NOTA: Este es un paso crítico como punción a través de la arteria renal puede ocurrir.
9. Conectar una jeringa llena con la solución de fármaco o solución salina (hasta 500 l) para el catéter y perfundir el riñón.
10. Inmediatamente después de la perfusión, la abrazadera de la vena renal izquierda y el uréter izquierdo con un clip microvascular y retirar el catéter. A continuación, coloque un trozo de esponja de gelatina absorbible pinza hemostática, con una pequeña gota de adhesivo tisular, sobre el área de punción de la aorta y aplicar una suave presión con un hisopo de algodón.
11. Al mismo tiempo, liberar la abrazadera de la aorta abdominal, por debajo de la bifurcación de la arteria renal izquierda. Después de 5 min, liberar la pinza de la vena renal y el uréter.
12. liberar con cuidado la abrazadera de la aorta, por encima de la bifurcación de la arteria renal izquierda, y permitir la reperfusión del riñón. La isquemia renal total debe durar no más de 7 min.
13. que no se produzca una hemorragia activa y observar de cerca a la zona durante 10 minutos más.
14. Cerrar la incisión abdominal en dos capas (músculo y piel), utilizando 4-0 suturas absorbibles y un patrón continuo para prevenir la infección. Además de la técnica de patrón de sutura continuo, otra opción sería utilizar una técnica simple, interrumpido, especialmente para el cierre de la pared del cuerpo para evitar la dehiscencia.
15. Aplique un ungüento antibiótico tópico sobre el área de la incisión para prevenir las infecciones.
16. La transferencia de la rata en una jaula de observación libre de la ropa de cama sobre una almohadilla caliente hasta la recuperación completa con un rango de temperatura entre 35-37 ° C. Ropa de cama suelta debe ser cubierto (por ejemplo con un paño o toalla de papel) o retirado de la jaula hasta los animales que se recuperan para evitar la asfixia o aspiración de ropa de cama.
17. Después de la cirugía, observar a los animales de forma continua hasta que respira espontáneamente, después cada hora durante unas horas. Vuelva a la dosis del analgésico Buprenorfina SR 72 hrmás adelante, si se observan signos de malestar, como letargo, encorvados y desaliñado, mueca, no reanudar las actividades normales.
18. Después de la terminación de todos los estudios, la eutanasia a los animales con la inhalación de una sobredosis de _CO2 y obtención de los tejidos renales para ex vivo tales como los análisis de histología y Western Blot ^5.

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Resultados

Hemos inyectado dos dosis diferentes de VEGF recombinante de rata (rrVEGF, 0,17 mg / kg y 5 mg / kg) o PBS. Los animales se sacrificaron 8 horas después de la cirugía para examinar la activación de la vía VEGF. El procedimiento quirúrgico no afectó la morfología del riñón perfundido (Figura 1A) en comparación con el control (Figura 1B), como se muestra por tinción con H & E. Mientras Sirius tinción con rojo no mostró ningún aument...

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Discusión

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370