Sıçan Böbrek için Biologies intravasküler teslim

Özet

Böbrek fonksiyonu geri kazanımı için ilaçların uygulanması lokalizasyonu ve tedavi bileşiğinin dağılımının kontrolünü gerektirir. Burada, detaylı sıçanlarda ilaçların intrarenal teslimat için basit bir teknik açıklar. Bu prosedür kolayca hiçbir ölüm ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile gerçekleştirilebilir.

Özet

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Giriş

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deneyler 250-300 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley fareleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Bilimler Akademisi, Bethesda, MD, ABD) ve için Kılavuzunda belirtilen standartlara uyup Bütün hayvan prosedürleri Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı Mayo Clinic Koleji tarafından kabul edildi ve kullanımı Komitesi (IACUC).

1. Hazırlık

1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletler otoklav. Farklı fareler üzerinde birden fazla ameliyatlar aynı gün içinde planlanan, her hayvan işleminden sonra durulama ve sonra sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize edin.
2. 1 L / dk O ₂ izofluran% 4 ile sıçan anestezisi.
3. 37 ° C 'de, vücut sıcaklığını muhafaza etmek için kontrollü ısıtma pedi sıçan aktarın. 1 L / dk O _2% 1-2 izofluran ile anestezi koruyun.
4. analjezik ilaç (Buprenorfin Release 0.6 mg / kg Sürekli) su yönetmebcutaneously.
5. İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözlere merhem sürün.
6. nedeniyle laparotomi vücut sıvılarının kaybını telafi etmek için, ameliyat öncesinde% 0.9 normal müsil, deri altından 10 ml / kg tatbik edilmesi önemlidir.
7. Karın bölgesi tıraş ve povidon-iyot ve% 70 etanol yastıkları ile cildi temizleyin.

2. Cerrahi Prosedür

1. sedasyon derinliği gibi ayak tutam çekilmesi, palpebral refleks, çene sesi ve solunum hızı / desen gibi fiziksel refleksleri, izleme yoluyla yeterli olduğundan emin olun.
2. Bir cerrahi neşter bıçak No. 10 kullanarak küçük bir orta hat kesi yoluyla bir laparotomi (uzunluğu 2-2,5 cm) gerçekleştirin.
3. pamuklu çubuklarla kullanarak karnın sağ tarafına bağırsak ve kolon çekin ve organları nemli tutmak için% 0.9 normal tuzlu için ıslatılmış steril gazlı bez ile bunları kapatın.
4. Yavaşça AOR maruz yukarı dalak, karaciğer, mide ve pankreas gerita ve sol böbrek arter.
5. Cerrahi mikroskop yardımıyla dikkatlice yukarıda ve sol böbrek ve damarları, yağ sol renal arter ve künt diseksiyon kavisli bir forseps ve steril pamuklu çevreleyen bağ dokusu altında abdominal aorta ayırın.
   1. yağ çıkarmak için bir yanal yuvarlanma hareketi ile bağ dokusu ve pamuk bezlerden kaldırmak için damarların uzunluğu boyunca tekrarlanan açma-kapama hareketi (künt diseksiyon) ile forseps kullanabilir.
      NOT: peri-aort bölgenin diseksiyonu zarar görmüş olabilir sinirler ve lenf damarları olarak çok hassas bir adımdır. diseksiyon işlemi sırasında tuzlu su ile nemli arterler tutmak için emin olun.
6. aorta altında 4-0 ipek sütür yerleştirin.
7. mikrovasküler klipleri kullanarak, (sadece superior mezenterik arterin altında) ve renal arter bifurkasyon altında yukarıda aort kelepçe.
8. Sol kidn seviyesinde aort delikler24 G intravenöz kateter ile ey arter dallanma ve renal arter içine kateter ilerlemek.
   NOT: Bu oluşabilir renal arter yoluyla delik olarak kritik bir adımdır.
9. kateter ilaç solüsyonu veya (500 ul kadar) tuzlu su ile dolu bir şırınga bağlayın ve böbrek serpmek.
10. Hemen perfüzyon sonra, bir mikrovasküler klip ile sol renal ven ve sol üreter kelepçe ve kateter çıkarın. Ardından, aortun delinmiş alanı üzerinde, doku yapıştırıcı küçük bir damla ile, emilebilen hemostat jelatin sünger bir parça koyun ve yavaşça bir pamuklu çubukla basınç uygulayın.
11. Aynı zamanda, sol renal arter bifurkasyon altında, abdominal aort kelepçeyi serbest bırakın. 5 dakika sonra, renal ven ve üreter kelepçeyi serbest bırakın.
12. Dikkatle sol renal arter bifürkasyonun üzerinde, aorta kelepçe bırakın ve böbrek reperfüzyon için izin verir. toplam renal iskemi, 7 dakika daha uzun sürmelidir.
13. aktif kanama meydana emin olun ve yakından 10 dakika daha alanını gözleyin.
14. enfeksiyonu önlemek için 4-0 emilebilir sütürler ve sürekli bir kalıbı kullanarak, iki kat (kas ve deri) karın kesisi kapatın. sürekli bir modeli dikiş tekniğine ilave olarak, başka bir seçenek yarılması önlemek için, özellikle vücut duvarı kapatılması için, basit bir kesintiye tekniği kullanmaktır.
15. enfeksiyonları önlemek için kesi alanı üzerinde topikal antibiyotik merhem sürün.
16. 35-37 ° C'de ayarlanmış bir sıcaklık aralığında tam iyileşme kadar sıcak bir pad üzerinde bir yatak ücretsiz gözlem kafesin içine sıçan aktarın. Gevşek yatak kaplı (örneğin drape veya kağıt havlu ile) ya da hayvanların tamamen boğulma ya da yatak aspirasyonu önlemek için iyileşene kadar kafes çıkarılmalıdır.
17. Ameliyattan sonra birkaç saat için saatlik, daha sonra kendiliğinden nefes kadar sürekli hayvanları gözlemlemek. analjezik Buprenorfin SR 72 saat yeniden dozDaha sonra rahatsızlık belirtileri gibi eğilmiş ve pasaklı uyuşukluk, face, normal aktivitelerini sürdürme değil, görülmesi halinde.
18. Tüm çalışmalar tamamlandıktan sonra, CO ₂ aşırı dozda inhalasyon ile hayvanların ötenazi ve ex vivo böbrek dokular gibi histoloji ve Western Blot ⁵ olarak analiz hasat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Rekombinant fare VEGF (rrVEGF, 0.17 ug / kg ve 5 mg / kg) ya da PBS iki farklı dozda enjekte edildi. hayvanlar VEGF yolunun aktivasyonunu incelemek için 8 saat sonrası ameliyat ötenazi uygulandı. H & E boyama ile gösterildiği gibi, kontrol (Şekil 1B) göre cerrahi işlem perfüze böbrek (Şekil 1A) morfolojisini etkilememiştir. Kontrol (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında Sirius kırmızısı ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370