Livraison intravasculaire de produits biologiques du rein de rat

Résumé

L'administration de médicaments pour la récupération de la fonction rénale nécessite un contrôle de la localisation et la distribution du composé thérapeutique. Ici, nous décrivons en détail une technique simple pour la livraison intrarenal de médicaments chez les rats. Cette procédure peut être facilement réalisée sans la mortalité et une reproductibilité élevée.

Résumé

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Introduction

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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Protocole

Les expériences ont été réalisées sur des rats Sprague-Dawley femelles, pesant 250 à 300 g. Toutes les procédures d'animaux conformes aux normes énoncées dans le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institut de laboratoire Ressources Animales, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) et ont été approuvés par la Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care et l'utilisation commission (IACUC).

1. Préparation

1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si de multiples interventions chirurgicales sur différents rats sont prévus dans la même journée, rincer les instruments après chaque procédure d'animal, puis stériliser à l'aide d'un stérilisateur à billes chaud.
2. Anesthetize le rat avec 4% d' isoflurane dans 1 L / min O _2.
3. Transférez le rat à un coussin chauffant contrôlé pour préserver la température du corps à 37 ° C. Maintenir l' anesthésie avec 1-2% d' isoflurane dans 1 L / min O _2.
4. Administrer le médicament analgésique (buprénorphine à libération prolongée de 0,6 mg / kg) subcutaneously.
5. Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la procédure.
6. Afin de compenser la perte de fluides corporels dus à la laparotomie, il est important d'administrer 10 ml / kg de 0,9% de solution saline normale sous-cutanée préopératoire.
7. Rasez la zone abdominale et nettoyer la peau avec des tampons d'éthanol povidone-iode et 70%.

2. Procédure chirurgicale

1. Assurez-vous que la profondeur de la sédation est adéquate en contrôlant les réflexes physiques, telles que le retrait de pincement de l'orteil, réflexe palpébral, de la mâchoire ton, et la fréquence respiratoire / pattern.
2. Effectuer une laparotomie à travers une petite incision médiane (2-2,5 cm de longueur) à l'aide d'une lame scalpel n ° 10.
3. Tirez l'intestin et du côlon sur le côté droit de l'abdomen à l'aide de tampons de coton et les couvrir avec de la gaze stérile trempée dans 0,9% de solution saline normale pour maintenir les organes humide.
4. rétracter doucement vers le haut de la rate, du foie, de l'estomac et du pancréas pour exposer le aorta et l'artère rénale gauche.
5. Avec l'aide d'un microscope chirurgical, séparer soigneusement l'aorte abdominale au-dessus et en dessous du rein gauche et l'artère rénale gauche dans les veines, la graisse et le tissu conjonctif entourant de dissection courbe pince émoussée et des cotons-tiges stériles.
   1. Utilisez la pince avec un mouvement (dissection) d'ouverture-fermeture répétée le long de la longueur des navires pour enlever le tissu conjonctif et les tampons de coton avec un mouvement de roulis latéral pour enlever la graisse.
      NOTE: La dissection de la région péri-aortique est une étape très délicate que les nerfs et les vaisseaux lymphatiques pourraient être endommagés. Assurez-vous de garder les artères humide avec une solution saline pendant la procédure de dissection.
6. Placer une suture 4-0 en soie sous l'aorte.
7. Au moyen de clips microvasculaires, serrer l'aorte au-dessus (juste en dessous de l'artère mésentérique supérieure) et au-dessous de la bifurcation de l'artère rénale.
8. Piquer l'aorte au niveau de l'KIDN gauchebifurcation de l'artère ey avec un cathéter intraveineux G 24 et de faire avancer le cathéter dans l'artère rénale.
   REMARQUE: ceci est une étape critique que la ponction à travers l'artère rénale peut se produire.
9. Connecter une seringue remplie de la solution médicamenteuse ou de sérum physiologique (jusqu'à 500 ul) au cathéter et perfuser le rein.
10. Immédiatement après la perfusion, serrer la veine rénale gauche et l'uretère gauche avec un clip microvasculaire et retirer le cathéter. Ensuite, placez un morceau de absorbable hémostatique éponge de gélatine, avec une petite goutte de colle de tissu, sur la zone poinçonnée de l'aorte et appliquer doucement la pression avec un coton-tige.
11. Dans le même temps, relâcher le serrage de l'aorte abdominale, au-dessous de la bifurcation de l'artère rénale gauche. Après 5 min, relâchez la pince de la veine rénale et de l'uretère.
12. Relâcher doucement la pince de l'aorte, au-dessus de la bifurcation de l'artère rénale gauche, et permettre rénale reperfusion. L'ischémie rénale totale ne devrait pas durer plus de 7 min.
13. veiller à ce qu'aucune hémorragie active se produit et observer de près la zone pendant 10 min.
14. Fermer l'incision abdominale en deux couches (muscles et de la peau), en utilisant 4-0 sutures absorbables et un motif continu pour prévenir l'infection. En plus de la technique continue motif de suture, une autre option serait d'utiliser une technique simple, interrompue, en particulier pour la paroi de fermeture du corps pour empêcher la déhiscence.
15. Appliquer une pommade antibiotique topique sur la zone d'incision pour prévenir les infections.
16. Transférez le rat dans une cage d'observation libre de la literie sur un tampon chaud jusqu'à ce que la récupération complète avec une plage de température réglée à 35-37 ° C. Literie en vrac doivent être couverts (par exemple avec un drap ou une serviette en papier) ou retiré de la cage jusqu'à ce que les animaux sont complètement rétablis pour prévenir la suffocation ou l' aspiration de la literie.
17. Après la chirurgie, observer les animaux en continu jusqu'à ce que la respiration spontanée, puis toutes les heures pendant quelques heures. Re-dose analgésique buprénorphine SR 72 hplus tard si des signes d'inconfort sont observés, tels que la léthargie, voûté et débraillé, grimace, ne pas reprendre ses activités normales.
18. Après l' achèvement de toutes les études, euthanasier les animaux à l'inhalation d'une overdose de CO ₂ et de récolter les tissus rénaux ex vivo pour des analyses telles que l' histologie et Western blot ^5.

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Résultats

Nous avons injecté deux doses différentes de VEGF recombinant de rat (rrVEGF, 0,17 pg / kg et 5 mg / kg) ou du PBS. Les animaux ont été euthanasiés à 8 heures après l'intervention chirurgicale pour examiner l'activation de la voie VEGF. La procédure chirurgicale n'a pas modifié la morphologie du rein perfusé (figure 1A) par rapport au contrôle (figure 1B), comme représenté par coloration H & E. Alors que Sirius colorati...

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Discussion

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370