쥐의 신장에 생물의 혈관 배달

요약

신장 기능의 회복을위한 약물의 투여는 현지화 및 치료 화합물의 분포 컨트롤이 필요합니다. 여기, 우리는 구체적으로 쥐에 약물의 신장 내 전달을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 절차는 쉽고없이 사망률과 높은 재현성으로 수행 될 수있다.

초록

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

서문

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

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프로토콜

실험은 250-300g 무게 암컷 흰쥐에서 수행 하였다. 실험실 동물의 관리 및 사용 (실험 동물 자원 연구소, 과학의 국립 아카데미, 베데스다, MD, USA)와 대한 설명서에 명시된 기준을 준수 모든 동물의 절차는 의학 기관 동물 관리의 메이요 클리닉 대학에 의해 승인되었다 및 사용위원회 (IACUC).

1. 준비

1. 수술 전에 수술 도구를 압력솥. 다른 쥐의 여러 수술이 같은 날에 계획하는 경우, 각 동물 절차 후 악기를 세척하고 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 소독.
2. 1 L / 분 O _2에서 4 % 이소 플루 란과 쥐를 마취.
3. 37 ° C의 체온을 유지하기 위해 조절 된 가열 패드로 쥐를 옮긴다. 1 L / 분 O _2에 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
4. 진통 약물 (부 프레 놀핀 릴리스 0.6 ㎎ / ㎏을 지속) 스와 관리bcutaneously.
5. 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
6. 개복에 의한 체액 손실을 보상하기 위해, 수술 전에 0.9 % 생리 식염수를 피하에 10 ㎖ / kg을 투여하는 것이 중요하다.
7. 복부 영역을 면도하고 포비돈 - 요오드 및 70 % 에탄올 패드​​로 피부를 청소하십시오.

2. 수술

1. 진정의 깊이는 발가락 핀치에서 철수, 눈꺼풀 반사, 턱 톤, 호흡 속도 / 패턴으로 물리적 반사 신경을 모니터링하여 적절한 지 확인합니다.
2. 수술 용 메스 블레이드 10 호를 사용하여 작은 중간 선 절개를 통해 개복술 (길이 2-2.5 cm)를 수행합니다.
3. 면봉을 사용하여 복부의 오른쪽에 소장과 대장을 당겨 기관 촉촉한 유지하기 위해 0.9 % 생리 식염수에 적신 멸균 거즈로 커버.
4. 조심스럽게 AOR을 노출 위쪽으로 비장, 간, 위장과 췌장을 철회타 왼쪽 신장 동맥.
5. 수술 현미경의 도움으로 조심스럽게 위 왼쪽 신장과 혈관, 지방에서 왼쪽 신장 동맥과 무딘 해부 곡선 집게와 멸균 면봉와 주변의 결합 조직 아래 복부 대동맥을 분리합니다.
   1. 지방을 제거하는 측면 회전 운동과 결합 조직과 면봉을 제거하기 위해 선박의 길이를 따라 반복 개폐 동작 (무딘 절개)와 집게를 사용합니다.
      참고 : 요정 대동맥 영역의 절개가 손상 될 수 있습니다 신경과 림프관으로 매우 민감한 단계입니다. 해부 과정에서 식염수로 촉촉한 동맥을 유지해야합니다.
6. 대동맥 아래 4-0 실크 봉합사를 놓습니다.
7. 미세 혈관 클립을 사용하여, (그냥 장간막 동맥 이하) 및 신장 동맥 분기 아래에 위의 대동맥 클램프.
8. 왼쪽 kidn 수준에서 대동맥 천공24 G 정맥 카테터와 EY 동맥 분기 및 신장 동맥에 카테터를 진행합니다.
   참고 :이 발생할 수 있습니다 신장 동맥을 통해 천자 등이 중요한 단계이다.
9. 카테터에 약액 또는 (500 μL까지) 식염수로 채워진 주사기를 연결하고 신장 관류.
10. 즉시 관류 후, 미세 혈관 클립 왼쪽 신장 정맥 왼쪽 요관을 고정하고 카테터를 제거합니다. 이어서, 대동맥 천공 영역에, 조직 접착제의 작은 방울, 흡수성 지혈제 젤라틴 스폰지 조각을 넣고 부드럽게 면봉으로 압력을 적용한다.
11. 동시에, 좌측 신장 동맥의 분기점 아래 복부 대동맥으로부터 클램프 해제. 5 분 후, 신장 혈관 및 요관에서 클램프를 놓습니다.
12. 조심스럽게 왼쪽 신장 동맥 분기 이상, 대동맥에서 클램프를 분리 한 신장 재관류를 허용합니다. 총 신 허혈은 7 분보다 더 오래 지속 없습니다.
활성 출혈이 발생하지 않도록 확인하고 밀접하게 10 이상 분의 영역을 관찰합니다.
13. 감염을 예방하기 위해 4-0 흡수성 봉합사 및 연속적인 패턴을 사용하여, 두 개의 층 (근육과 피부)의 복부 절개를 닫는다. 연속 패턴 봉합 기술에 더하여, 또 다른 옵션은 열개 않도록 특히 체벽 폐쇄위한 간단한 인터럽트 기술을 사용하는 것이다.
14. 감염을 방지하기 위해 절개 영역에 국소 항생제 연고를 적용합니다.
15. 35-37 ° C에서 설정된 온도 범위 전체 복구 될 때까지 따뜻한 패드에 침구없는 관찰 케이지에 쥐를 전송합니다. 느슨한 침구 커버 (예 : 드레이프 또는 종이 수건)이나 동물이 완전히 질식 또는 침구의 구토물이기도를 막는 것을 방지하기 위해 복구 될 때까지 케이지에서 제거해야합니다.
16. 수술 후 몇 시간 동안 매 시간 후, 자발적으로 호흡 할 때까지 지속적으로 동물을 관찰한다. 진통 부 프레 놀핀 SR 72 시간을 다시 투여 량나중에 불편의 흔적은 같은 웅크 리고 앉게하고 초라한 혼수, 얼굴을 찡 그리기, 정상적인 활동을 재개하지으로 관찰하는 경우.
17. 모든 연구 종료 후, CO _2의 과다 복용의 흡입과 동물을 안락사와 생체의 신장 조직은 조직 학적 및 웨스턴 블로 팅 ^(5)로 분석 수확.

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결과

우리는 재조합 쥐 VEGF (rrVEGF, 0.17 μg의 / kg, 5 μg의 / kg) 또는 PBS의 두 가지 용량을 주입. 동물은 VEGF 경로의 활성을 검사 8 시간 포스트 수술을 안락사시켰다. H & E 염색으로 도시 된 바와 같이, 제어부 (도 1b)에 비해 수술은 관류 신장 (도 1a)의 형태에 영향을 미치지 않았다. 제어 (그림 1D)에 비해 시리우스 레드 염색은...

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토론

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370