משלוח intravascular של מוצרים ביולוגיים לכליה עכברוש

Summary

בנוסף, לשימוש בתרופות עבור התאוששות של תפקוד כליות מחייב שליטה של ​​הלוקליזציה וההפצה של המתחם הטיפולי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה פשוטה למסירת intrarenal של סמים בחולדות. הליך זה עשוי להתבצע בקלות ללא תמותת שחזור גבוה.

Abstract

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

Introduction

The renal microvasculature is involved in a wide spectrum of kidney diseases. Depending on the pathophysiology of disease, the endothelial cells may present structural or functional impairment, which may play a pivotal role in propagating kidney damage by creating an ischemic microenvironment. This renal microvascular dysfunction may catalyze the onset of a progressive deterioration of renal function over time, leading to chronic kidney disease (CKD), end-stage renal disease, hypertension and cardiorenal syndrome. In fact, untreated hypertension may have implications in renal arterioles, causing nephrosclerosis or glomerulosclerosis with significant reduction in vascular volume fraction, increase in vascular resistance and development of tubulointerstitial fibrosis¹.

Loss of renal microvasculature may be due to altered vascular homeostasis induced by local angiogenic/anti-angiogenic factors imbalance. This correlates with attenuated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) signaling as well as elevated thrombospondin-1^2-4. Thus, using different animal models (mice, rats and pigs), the therapeutic effect of exogenous administration of VEGF has been recently investigated in some forms of renal disease, showing reduced interstitial fibrosis and stabilized renal and cardiac function^3-5. This effect is likely due to actions of VEGF on endothelial cells of the microvascular bed and inflammatory monocyte phenotype switching⁶.

For some preclinical studies, the use of rodents, the most commonly used laboratory animals, provides a good animal model for high throughput studies due to relatively low costs and ease of handling. Moreover, the use of genetically-altered rats as models of human diseases, such as hypertension, has become more and more frequent in the scientific community. Therefore, the aim of this protocol is to describe a useful intrarenal VEGF delivery technique in rats that is easy to perform and highly reproducible. Moreover, the same method can be used to selectively deliver other drugs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הניסויים בוצעו על חולדות נקבות ספראג-Dawley, במשקל 250-300 גרם. הנהלים כל חיה בסטנדרטים הנקוב מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון משאבים בחיות מעבדה, האקדמיה הלאומית למדעים, Bethesda, MD, USA) ואושרו על ידי הקולג 'מרפאת מאיו של טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואה ועדת שימוש (IACUC).

1. הכנה

1. חיטוי את כל מכשירי הניתוח לפני הניתוח. אם מספר ניתוחים על חולדות שונות מתוכננים באותו היום, לשטוף כלים אחרי כל הליך חיה ואז לעקר באמצעות מעקר חרוז חם.
2. להרדים חולדה עם isoflurane 4% ב 1 L / min O _2.
3. מעבירים את החולדה כרית חימום מבוקר לשמר את טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס. לשמור על הרדמה עם isoflurane 1-2% ב 1 L / min O _2.
4. את התרופה לשיכוך כאבים (עצירות מתמשכת שחרור 0.6 מ"ג / ק"ג) subcutaneously.
5. החל משחה על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ההליך.
6. על מנת לפצות על אובדן של נוזלים בגוף עקב laparotomy, חשוב לנהל 10 מ"ל / ק"ג של תת-עורית מלח רגיל 0.9% לפני הניתוח.
7. לגלח את אזור הבטן ולנקות את העור עם povidone- יוד 70% רפידות אתנול.

2. הליך כירורגי

1. ודא שעומק ההרגעה הוא נאות על ידי ניטור רפלקסים פיזי, כגון נסיגת קמצוץ בוהן, רפלקס palpebral, טון לסת, ו / דפוס קצב נשימה.
2. בצע פיום בטן דרך חתך קו האמצע קטן (2-2.5 ס"מ אורך) באמצעות מס 'להב סכין המנתחים כירורגית 10.
3. משוך את המעי הגס לצד ימין של הבטן באמצעות צמר גפן ומכסים אותם עם גזה סטרילית ספוגה 0.9% מלח רגיל כדי לשמור על איברים לחים.
4. בעדינות לחזור בו כלפי מעלה הטחול, הכבד, הקיבה והלבלב לחשוף את בזת"א ואת עורק הכליה השמאלית.
5. בעזרת מיקרוסקופ כירורגי, בזהירות להפריד את אבי העורקים בבטן מעל ומתחת כליות עזב ואת עורק הכליה השמאלית מן הוורידים, השומן ורקמת חיבור המקיפה עם מלקחיים מעוקל לנתח בוטה צמר גפן סטרילי.
   1. השתמש מלקחיים עם תנועה פתוחה קרוב חזרתי (דיסקציה קהה) לאורכו של הכלי להסרת רקמת חיבור ואת צמר גפן עם תנועה סיבובית לרוחב כדי להסיר את השומן.
      הערה: דיסקציה של האזור פרי-אב העורקים היא צעד מאוד עדין כמו עצבים וכלי הלימפה עלול להינזק. הקפד לשמור על העורקים לחים עם מי מלח במהלך ההליך לנתיחה.
6. מניחים תפר משי 4-0 מתחת האאורטה.
7. באמצעות קליפים כלי דם, מהדק את אב העורקים לעיל (ממש מתחת עורק mesenteric המעולה) ומתחת הסתעפות עורק הכליה.
8. לנקב את אבי העורקים ברמה של kidn שמאלהסתעפות עורק EY עם קטטר 24 G תוך ורידים ולקדם קטטר לתוך עורק הכליה.
   הערה: זהו צעד קריטי כמו לנקב דרך עורק הכליה עלולה להתרחש.
9. חבר מזרק מלא עם פתרון סמים או מלוחים (עד 500 μl) כדי קטטר perfuse הכליה.
10. מיד לאחר זלוף, מהדק את עורק הכליה שמאלה השופכן השמאלי עם קליפ כלי הדם ולהסיר את הקטטר. ואז, במקום חתיכת ספוג הג'לטין hemostat נספג, עם טיפה קטנה של דבק רקמות, מעל האזור המנוקב של האאורטה בעדינה להפעיל לחץ עם מקלון צמר גפן.
11. במקביל, שחרר את המהדק מ אב העורקים בבטן, מתחת הסתעפות עורק הכליה השמאלית. לאחר 5 דקות, לשחרר את מהדק מ עורק הכליה ו שופכן.
12. בזהירות לשחרר את המהדק מן האאורטה, מעל הסתעפות עורק הכליה השמאלית, ולאפשר reperfusion כליות. איסכמיה כלייתית בסך הכל צריכה להימשך לא יותר מ -7 דקות.
13. ודא שאף דימום פעיל מתרחש ועקוב בקפידה אחרת באזור במשך 10 דקות יותר.
14. סגירת החתך בבטן בשתי שכבות (שרירים ועור), באמצעות 4-0 תפרים נספגים ו דפוס מתמשך כדי למנוע הידבקות. בנוסף לטכניקת התפר המתמשכת דפוס, אפשרות נוספת תהיה להשתמש בטכניקה פשוטה, קטע, במיוחד לסגירת קיר גוף כדי למנוע בקיעה.
15. החל משחה אנטיביוטית מקומית על אזור החתך כדי למנוע זיהומים.
16. מעביר את החולדה לכלוב תצפית מצעים נטולים על כרית חמה עד להחלמה מלאה עם טווח טמפרטורות נקבע על 35-37 מעלות צלזיוס. מצעי Loose צריכים להיות מכוסים (למשל במגבת וילון או נייר) או יוסרו הכלוב עד חיות הם התאוששו באופן מלא כדי למנוע חנק או שאיפה של מצעים.
17. לאחר הניתוח, יש למלא אחר החיות ברציפות עד נושם באופן ספונטני, אז לפי שעה במשך כמה שעות. Re-מינון hr SR 72 עצירות כאביםמאוחר יותר, אם סימני הסבל הם נצפו, כגון עייפות, שפופה, מוזנחת, עווית, לא חידוש לפעילות רגילה.
18. לאחר השלמת כל המחקרים, להרדים חיות עם שאיפה של מנת יתר של CO ₂ ולאסוף את רקמות הכליה עבור vivo לשעבר ניתוחים כגון היסטולוגיה ומערב סופג ^5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הזרקנו שני מינונים שונים של VEGF עכברוש רקומביננטי (rrVEGF, 0.17 מיקרוגרם / ק"ג ו 5 מיקרוגרם / ק"ג) או PBS. החיות היו מורדמים 8 שעות שלאחר הניתוח לבחון את שפעול מסלול VEGF. הליך כירורגי לא השפיע על המורפולוגיה של הכליה perfused (איור 1A) בהשוואה לשליטה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The increasing incidence of chronic kidney disease raises the need for novel therapeutic approaches that can promote functional kidney recovery^7,8. Traditional therapies include the systemic administration of anti-inflammatory, anti-fibrotic drugs⁹. However, these strategies are frequently characterized by unwanted side effects due to off-target distribution of the injected drug. Therefore, in this manuscript, we describe a simple procedure for delivering drugs into the renal artery of rats. This pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Microscope	Leica	M125
Isoflurane 100 ml	Cardinal Healthcare	PI23238	Anesthetic
Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity).                                                        Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe.                                                           Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE.
Puralube Vet Ophthalmic Ointment	Dechra	NDC17033-211-38	Sterile ocular lubricant
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container	Baxter Healthcare Corp.	NDC0338-0117-02	For body fluids replacement
Sol Povidone-Iodine  Swabstick, 3'	Cardinal Heatlhcare	23405-010B
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
4-0 silk suture (without needle)	Cardinal Heatlhcare	A183H
Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw	World Precision Instruments	501779-G
I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer	Jelco	4053
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010023
SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge	Cardinal Healthcare	179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER	Ethicon	VCP304H	For muscle layer suturing
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING	Ethicon	VCP845G	For skin layer suturing
Triple antibiotic ointment	Actavis	NDC0472-0179-56	For topical use on the site of the incision
Recombinant Rat VEGF 164 Protein	R&D Sytems	564-RV
Rabbit monoclonal VEGFA	Abcam	ab46154
Rabbit monoclonal FLK1	Cell Signaling	9698
Rabbit monoclonal AKT	Cell Signaling	4691
Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473)	Cell Signaling	4060
Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell Signaling	4695
Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204)	Cell Signaling	4370