حديثي الولادة القلب السقالات: مصفوفات رواية للدراسات التجدد

Summary

في هذه الدراسات، ونحن نقدم منهجية للرواية، حديثي الولادة، السقالات القلب الفئران للاستخدام في الدراسات التجدد.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

فشل القلب هو شائع وقاتل. وهو مرض التدريجي الذي يؤدي إلى انقباض انخفضت من القلب، الذي يعوق تدفق الدم إلى الأعضاء ويترك مطالب التمثيل الغذائي في الجسم تتم تلبيتها. ويقدر أن 5.7 مليون أميركي يعانون قصور القلب وهذا هو السبب الرئيسي في المستشفى في الولايات المتحدة ^9. تكلفة الجماعية لعلاج المرضى في فشل القلب في الولايات المتحدة يتجاوز 300 مليار $ دولار سنويا ^9-10. العلاج النهائي الوحيد للفشل نهاية المرحلة القلب هو مثلي زرع القلب. في كل عام، وتشير التقديرات إلى أن هناك حاجة إلى أكثر من 100،000 قلوب المانحة لعمليات زرع القلب في الولايات المتحدة الأمريكية ^1-2. ويرجع ذلك إلى عدد محدود من الجهات المانحة، يتم تنفيذ سوى ما يقرب من 2400 عملية زراعة سنويا في الولايات المتحدة ^(2). بوضوح، يحتاج هذا النقص الجهاز لمعالجتها كما هو مطلوب استراتيجيات أخرى لإنتاج أجهزة إضافية لtransplantaنشوئها، ومن الناحية المثالية، هذه الأجهزة سيكون ذاتي وذلك لتجنب المضاعفات المرتبطة الرفض وكبت المناعة مدى الحياة.

العضلية الكبار الثدييات يبرهن على وجود قدرة على التجدد محدودة على الاصابة لكن تشير أدلة حديثة أن قلوب الأطفال حديثي الولادة الثدييات الحفاظ على القدرة على التجدد ملحوظة بعد الاصابة ^5-8. على وجه التحديد، وبعد استئصال الجراحي الجزئي، وقد تم اكتشاف نافذة التجديدي بين الولادة وبعد الولادة يوم 7. وتتميز هذه الفترة التجدد بسبب عدم وجود ندبة متليفة، وتشكيل اتساع الأوعية الدموية، وإطلاق سراح من العوامل عائية من النخاب، وcardiomyocyte انتشار ^{5-8 11.} يوفر هذا الإطار التجدد الوقت إمكانية استخدام قلب الأطفال حديثي الولادة كمصدر جديدة من مواد لتطوير قلب bioartificial.

ومن المعروف أن المصفوفة خارج الخلية لتقديم العظة هامة لتعزيز cardiomyocytالبريد انتشار والنمو. وقد استكشفت اختلافات واضحة في توافر الجزيئات في المصفوفات حديثي الولادة والبالغين ¹² و قدرتها على تشجيع تجديد ^13. وقد استخدمت المصفوفات الكبار Decellularized في العديد من الدراسات لتوفير سقالة ECM لإعادة تعمير الخلوي وتوليد قلب bioartificial. في حين أن هذه الدراسات والاكتشافات الجديدة في مجال تكنولوجيا الخلايا الجذعية، تحقق تقدما سريعا، لها عدة عقبات لم تتحقق بعد. على سبيل المثال، القيود في الحفاظ على بنية الأصلي للمصفوفة، والتكامل الخلوي في الجدار مصفوفة، والقدرة على دعم انتشار ونمو كل حد في نجاح هذا النهج. في حين نسبت سمات التجدد متفوقة على قلب الأطفال حديثي الولادة، والجوانب العملية لاستخدام هذه الأنسجة محدودة التنقيب.

وبناء على القدرة التجديدية أثبت للقلب الأطفال حديثي الولادة، وقد وضعنا مصفوفات جديدة من خلال تطويرتقنية decellularization للقلب P3 الماوس. وقد تم اختيار قلب P3 لهذه الدراسات كما هو ضمن إطار التجديد القلب كما سبق تحديدها ⁶ ولكن القلب هو كبير بما يكفي لموسم الحصاد، decellularize وrecellularize. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار جدوى إنشاء مصفوفة من قلب فأر حديثي الولادة. توفر دراستنا دليلا على جدوى decellularizing دقيقة واحدة، قلب الأطفال حديثي الولادة مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والبروتينية إدارة المحتوى في المؤسسة. علينا أن نبرهن أيضا القدرة على recellularize هذا ECM القلب مع mCherry العضلية التعبير ولقد درست هذه العضلية للتعبير عن مختلف علامات القلب التالية recellularization. ستسمح هذه التقنية لللاختبار تفوق مصفوفة حديثي الولادة لتطوير قلب bioartificial.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب الماوس وفقا لقانون رعاية الحيوان الولايات المتحدة وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة مينيسوتا.

1. طريقة للماوس القلب العزلة

1. الموت ببطء الماوس حديثي الولادة عن طريق قطع الرأس مع استخدام شفرة واحدة.
2. مسحة الصدر مع 70٪ من الإيثانول.
3. تشريح الجلد من الصدر عن طريق قطع بعيدا عن جدار الصدر مع مقص القياسية في حين سحب الجلد أفقيا مع زوج من ملقط # 5.
4. خرم البطن فقط أقل شأنا من القص مع مقص من خلال قطع جدار البطن. استيعاب عملية الخنجري مع ملقط # 5، التراجع عن القص rostrally من الجسم في حين قطع على الرغم من أن الضلوع على جانبي الصدر مع مقص. وينعكس القفص الصدري متفوق مع ملقط للكشف عن القلب.
5. بصراحة تشريح اثنين من الفصوص الرئيسية للالغدة الصعترية عن طريق سحب أفقيا مع # 5 ملقط، وتعريضقوس الأبهر، وكذلك الأوردة الأجوف والرئوية.
6. القطع الشرايين الرئيسية من قوس الأبهر، والشريان الأورطي نفسه، مع مقص الربيع 10 سم. الإبقاء على الشريان الأورطي بين قاعدة من القلب والشريان العضدي الرأسي. فهم نهايات الأوعية قطعت مع # 5 ملقط لتعكس القلب إلى الأمام، يفصل بينه وبين القصبة الهوائية والمريء.
7. القطع والأوعية الدموية الرئوية والأوردة الرئيسية الأخرى، عن طريق قطع بين الرئتين والقلب على جانبي القلب مع مقص الربيع 10 سم. لا تزال الأوردة المفتوحة لتوفير الصرف الصحي.
8. إزالة القلب من المنصف مع ملقط 5 #، واستيعاب نهايات قطعت من السفن الكبرى. وضع القلب في طبق ثقافة 60 ملم تحتوي على معقم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لالقسطرة.

2. طريقة لDecellularization التي كتبها Langendorff الإرواء

1. إعداد الجمعية القسطرة مقدما. يوجه جزء 4 سممن PE 50 أنابيب في لهب الكحول صغيرة لخلق، قسطرة أصغر أرق. تقليم ينتهي بشفرة لمواجهة أبعاد (تقريبا 300 ميكرومتر الخارجي OD قطر مع شفة تقريبا. OD 500 ميكرون) هو مبين في الشكل 1، وهذا سيوفر اثنين القسطرة متناظرة من كل جانب من سحب.
2. تدل على نهاية قطع من أنابيب في لهب لفترة وجيزة، لتذوب شفة على افتتاح في نهاية رقيقة.
3. ملء الحقنة 12 مل مع برنامج تلفزيوني وتجميع القسطرة عن طريق وضع 3-الطريقة محبس على حقنة. إضافة 22 G × 1 الإبرة إلى محبس ودفع الإبرة من خلال الحاجز. حرك رسمها PE أنابيب القسطرة على الإبرة (الشكل 1).
4. لري أجزاء مجمعة مع برنامج تلفزيوني، مؤكدا أنه تمت إزالة جميع فقاعات الهواء.
5. إدراج القسطرة، أعدت على النحو المبين أعلاه، في الشريان الأورطي في القلب معزولة، لا تمتد الماضي الصمام الأبهري وligate مع ربطة عنق واحد من 7-0 خياطة. ضع شفة رانه قثطار قريب ضد ربطة عنق، وجعل ختم مشددة ومنع القلب من نزوله القسطرة.
6. مراقبة القسطرة تحت التكبير، في حين perfusing بلطف القلب باستخدام حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني. تأكد من عدم وجود تسرب في النظام والنسيج يبيض متجانس كما هو إزالة الدم الكامنة.
7. وضع الحاجز في عنق محول مدخل وختم ذلك عن طريق طي الجانبين على الزجاج.
8. إرفاق خزان مليئة 60 مل من 1٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) في الماء المقطر (DH ₂ O) عبر خط طول كاف لإنتاج العمود الذي يولد 20 ملم زئبق ضغط كما هو مبين في الشكل. 1 أحسب ضغط من ارتفاع عمود السائل على أساس العلاقة بين 1 ملم زئبق يساوي 1.3595 سم H ₂ O.
   تحذير: SDS هو مسحوق صوفانية للغاية مع خصائص مهيجة. وينبغي تجنب الاتصال. التعامل مع مسحوق باستخدام الملابس الواقية المناسبة.
9. يروي القلب مع 1٪ SDS لمدة 14 ساعة. سيتم شفافة القلب في المظهر مع عدم وجود الأنسجة المتبقية ملاحظتها.
10. مسح نظام يصل إلى محبس من الحل SDS المتبقية واستبدالها مع 10 مل درهم ₂ O. يروي القلب مع 10 مل 1٪ تريتون X-100 (المخفف في الماء المقطر)، تليها 10 مل O ₂ درهم، يليه 60 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني الستربتومايسين البنسلين 1X (القلم بكتيريا).
11. تخزين قلب في برنامج تلفزيوني مع 1X القلم بكتيريا في 4 درجات مئوية. إذا كان التطبيق آخر decellularization المقصود يتطلب نضح ثم ينبغي الحفاظ القسطرة في الشريان الأورطي، وقطع وإلا فإن التعادل خياطة وإزالة القسطرة.

تحديد 3. الحمض النووي

1. إعداد ملخص للECM أو مراقبة القلب decellularized باستخدام 200 ميكروغرام / مل بروتين كاف في 50 ملي بوكل، 2.5 ملي MgCl _2، 0.45٪ توين 20 في 10 ملي تريس (درجة الحموضة 8.3).
2. احتضان الأنسجة عند 55 درجة مئوية مع الإثارة حتى يذوب الأنسجة،عادة 4-5 ساعة.
3. Quantitate محتوى الحمض النووي للجناسة مع الحمض النووي فحص ^4،11 ملزمة.

4. التثبيت وباجتزاء من الأنسجة

1. إصلاح decellularized، recellularized أو السيطرة P3 قلوب في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3X.
3. وضع الأنسجة في حل من 7.5٪ سكروز في 0.1 العازلة الفوسفات M في 4 درجات مئوية حتى تغرق.
4. تغيير الحل إلى 15٪ سكروز في 0.1 العازلة الفوسفات M في 4 درجات مئوية، مرة أخرى، إلى أن المصارف.
5. تسخين الأنسجة إلى 37 درجة مئوية، استبدال نصف حجم بمحلول الجيلاتين في 15٪ سكروز و 0.1 م العازلة الفوسفات ويوازن بين عشية وضحاها. وزادت تركيزات الجيلاتين تدريجي من خلال 1٪، 2.5٪، 5٪، وأخيرا 7.5٪ مرتين.
6. وضع العينات في cryomolds باستخدام الطازج 7.5٪ الجيلاتين. لاستعادة شكل من العينات decellularized، الجيلاتين السائل يمكن perfused في غرف كما روتتشكل انه القلوب. تجميد من قبل تعويم cryomolds على النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية.
7. قطع (10 ميكرون سميكة) المقاطع مع ناظم البرد. جلب الشريحة على مقربة من الباب السطحية ومراقبة قسم تتحرك الخروج من سكين على السطح بسبب التهمة على الشرائح تعامل كهربية. تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها وتخزين في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
8. إزالة الشرائح من الثلاجة، تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة ثم ضع في جرة Coplin تحتوي على برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية إلى حل الجيلاتين.
9. وصمة عار على قطع مقاطع من الخطوة 4.7 مع الهيماتوكسيلين ويوزين. مكان الشرائح في جرة Coplin. كشف الشرائح رطب في الخطوة 4.8 إلى الهيماتوكسيلين لمدة 45 ثانية، والاستفادة من المياه لمدة 1.5 دقيقة، العازلة لمدة 3 دقائق، ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة، الصبغة الزرقاء وكيل ل1.5 دقيقة، 80٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة، المشروبات الكحولية يوزين Y لمدة 8 ثانية، 80٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة، و 100٪ من الإيثانول ل1 2X دقيقة، وتطهير وكيل (زيلين بديل) لمدة 1 دقيقة 3X، ساترة مع الراتنجالمستندة إلى تصاعد المتوسط. فحص الشرائح مجهريا.
10. لتأكيد الإبقاء على ECM البروتين التفاعل من ECM القلب، وصمة عار لECM البروتينات الهيكلية مثل الكولاجين الرابع عن طريق وضع الشرائح المائية في غرفة ترطيب وعلاج مع 10٪ الحمار العادي المصل (NDS) في الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1٪ تريتون -X100 (PBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام كمية كافية لتغطية أقسام الأنسجة.
11. استبدال حل مع الأجسام المضادة الأولية من خيار في والتخفيف العزم تجريبيا في 5٪ NDS / PBST. على سبيل المثال، كان المخفف الأجسام المضادة الكولاجين الرابع في 1: 150. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
12. تغسل الشرائح مع PBST 3X وتطبيق الضد الثانوية الاختيار مترافق مع صبغة الفلورسنت. تمييع الضد بمبلغ تحدد تجريبيا. احتضان لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3X.
13. وصمة عار على الشرائح مع صبغة الحمض النووي ملزم مثل دابي للتحقق من عدم وجود نواة الخلية باستخدام mounti دابي تحتوي علىنانوغرام المتوسطة عندما غطاء الانزلاق الشرائح.
14. دراسة الشرائح مع المجهر الفلورسنت في 50 و 400X.

5. P1 حديثي الولادة الفئران البطيني العضلية للRecellularization

1. رش كل الجرو مع الايثانول 70٪ وقطع رأس مع استخدام شفرة واحدة.
2. عقد كل الجرو بين الإبهام والسبابة في حين يتم تقسيم الصدر في خط الوسط مع مقص العقيمة صغيرة لكشف التجويف الصدري. الضغط للسماح للقلب لتبرز بحرية من الصدر بينما يتم قطع عليه مجانا من السفن الكبرى والأذينين ولم يتبق سوى نسيج البطين.
3. ضع كل قلب مباشرة في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل الجليد الباردة الكالسيوم، محلول ملحي مخزنة كربونات مجانا هانك مع 20 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) حتى يتم جمع كل القلوب.
4. نضح CBFHH وإضافة 10-15 مل من CBFHH جديدة (المثلج) إلى أنبوب. غسل الأنسجة عن طريق يحوم الأنسجة في تيكان أنبوب عدة مرات.
5. صب محلول يحتوي على قلوب الى 60 ملم البلاستيك طبق بتري.
6. تشريح أي نوع من الأنسجة الأذيني الكامنة من قلوب تحت التكبير على الجليد وتقليم بعيدا عن قلوب مع مقص الربيع. اللحم المفروم حتى البطينين إلى قطع صغيرة الحجم متجانس. إزالة أي فصل الأنسجة غير البطين-من الطبق مع ملقط # 5.
7. الماصة مثل كثير من الحل CBFHH كما هو مطلوب لنقل أجزاء الأنسجة إلى قارورة معقمة صغيرة تحتوي على بقضيب الصغيرة العقيمة.
8. السماح للأنسجة لالرواسب في قاع القارورة وإزالة حل CBFHH.
9. يشكلون 50 مل من محلول أنزيم 1.75 ملغ / مل التربسين، 20 ميكروغرام / مل الدناز الثاني في CBFHH. الماصة 5 مل من هذا المحلول انزيم وإضافته إلى أنبوب يحتوي على مفروم النسيج البطين ومكان على محرك مغناطيسي. يحرك بمعدل ثابت (340 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
   ملاحظة: يجب أن يكون العمل التحريك لطيف وتسمح حتى الآنللتعليق على الطين.
10. إزالة قارورة من لوحة ضجة والسماح الطين إلى الرواسب لمدة 3 دقائق. الماصة وتجاهل الهضم الأولي طاف، كما أنه يحتوي على خلايا الدم في المقام الأول والحطام الأنسجة.
11. الماصة والثانية 5 مل قسامة من الحل الانزيم وإضافته إلى البطين هضم. تحرك المكونات لمدة 8 دقائق والسماح لها الرواسب لمدة 3 دقائق أخرى. قبل بداية هضم، وإعداد كل منهما 50 مل أنابيب (المسمى 1 و 2) تحتوي كل منها على 12 مل الجليد الباردة مصل بقري جنيني (FBS). وضع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر فوق كل أنبوب. الماصة هذا طاف من خلال مرشح في أنبوب 1.
12. تكرار عملية الهضم 8 مرات إضافية، بالتناوب موضع طاف هضم بين اثنين من الأنابيب التي تحتوي على FBS. تقسيم طاف الماضي مناصفة بين أنابيب 1 و 2 لضمان كميات متساوية في كل أنبوب.
    ملاحظة: كل أنبوب جمع يحتوي الآن 32.5 مل الحجم الكلي للتعليق الخلية.
13. أنابيب الطرد المركزي تحتوي علىجى x ج طاف 150 لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
14. في حين جمع قسامات الهضم، وإعداد خمسة 100 لوحات زراعة الأنسجة ملم مع 6 مل من وسائل الاعلام (Dulbecco لتعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) مع 10٪ FBS، 1X القلم بكتيريا، 1X L-الجلوتامين) لكل لوحة. احتضان هذه aliquots في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن وسائل الإعلام.
15. نضح الانزيم خليط CBFHH و resuspend الخلايا في 30 مل من وسائل الإعلام ثقافة أعد أعلاه، والجمع بين الخلايا من كلا أنابيب جمع.
16. عودة 6 مل من خلية إلى تعليق كل من لوحات 100 ملم واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
17. في نهاية الحضانة، ونقل الخلايا غير ملتصقة إلى 5 أطباق جديدة وإعادة احتضان لمدة 45 دقيقة (جزء الليفية وبدأت التمسك أطباق ويمكن زراعتها بشكل منفصل إذا رغبت في ذلك).
18. في نهاية الجولة الثانية من مرحلة ما قبل الطلاء، وجمع وسائل الإعلام والخلايا غير ملتصقة من الأطباق وتدور وسائل الإعلام في 150x ج لمدة 6 دقائق.
19. رسم من وسائل الإعلام الزائدة لجعل الخلايا إلى التركيز المطلوب تقريبي، (4.0 × 10 ⁵ خلايا لكل بناء في 100 ميكرولتر من الإرواء). إزالة قسامة عن العد وأو قابلية الاختبار ^14.

6. مفاعل حيوي Recellularization من P3 القلب مصفوفة

1. يمهد للمعالجة المصفوفة القلب معزولة مع وسائل الإعلام الثقافة (راجع الخطوة 5.15) بين عشية وضحاها قبل إضافة الخلايا.
2. تجميع عناصر نظام Langendorff كما هو مبين في الشكل. 2. الأوتوكلاف أجزاء الزجاج وأكسيد الإثيلين تعقيم وقطع من البلاستيك لضمان العقم. وحدات فرعية مختلفة من نظام يمكن تجميعها في غطاء تدفق الصفحي قبل أن تكون محمولة على موقف الدعم. لقد تم حذف تعميم حمام الماء ويسخن مسار تدفق المياه من أجل الوضوح.
3. ملء نظام تجميعها مع 120 مل من وسائل الاعلام زراعة الأنسجة (راجع الخطوة 5.15).
4. وضع مصفوفة القلب مقسطر من الخطوة 2.14 في طريق مسدود 60 ممطبق البنية تحت التكبير وتوصيل حقنة 1 مل مع 22 G × 1 إبرة محملة تعليق الخلية من الخطوة 5.20 إلى القسطرة. تأكد من أن هذا التجمع هو خال من فقاعات الهواء لتجنب embolizing القلب.
5. يروي بلطف 100 ميكرولتر من تعليق خلية في المصفوفة القلب عبر الشرايين التاجية. مرة واحدة كاملة، فصل مزيج حقنة / إبرة.
   ملاحظة: نضح بطيئة تقريبا. مطلوب 20 ميكرولتر لكل دقيقة لمنع الخلايا من المتدفقة من الأوردة والتي تمر عبر القلب.
6. مع كعب حادة 22G تأمينها لتركيب لور على الجانب السفلي من جرة غطاء مفاعل حيوي القلب، ودفع القسطرة على كعب.
7. بدء تشغيل مضخة تحوي ونلاحظ أن عائدات تدفق على النحو المبين في الشكل 2. عائدات التدفق من الخزان عن طريق مضخة من خلال فخ فقاعة لالقسطرة وضعها في الشريان الأورطي في الخطوة 2.5 (مسار أحمر في الشكل 2). مراقبة تدفق الدورة الدموية في القلب من الوريدالصورة والتنقيط من قمة، إعادة تدوير إلى الخزان وسائل الإعلام.
   ملاحظة: معدل تدفق نضح يعتمد على العوامل الفردية مثل مقاومة الأوعية الدموية للبناء، وحجم القلب، ولكن بمعدل 50 إلى 100 ميكرولتر / دقيقة هو نقطة انطلاق جيدة. في نقطة زمنية وسيطة، وتقييمات وظيفية يمكن تنفيذها. مقياس حجم القلب recellularized حديثي الولادة يحد من التقييمات، التي يمكن القيام بها لكننا مصممون على النظم القائمة بصريا يمكن أن تستخدم لتحديد الضرب السلوك تماما كما أنها استخدمت في قلوب الفئران البالغة. ⁴ يمكن perfused في بناء لمدد فترات من الزمن (تصل إلى 23 ساعة).

النتائج

Decellularization
في المتوسط، والوقت لdecellularization من قلب P3 باستخدام هذا البروتوكول ما يقرب من 14 ساعة. يعطى متوسط ​​وزن القلب من 23 ملغ لحديثي الولادة P3.

Acellularity
يوضح الشكل...

Discussion

اعتماد هذه التقنية على تروية دموية متكررة من القلب يجعل تلافي حدوث الانسداد عنصر حاسم في تحقيق نتائج ناجحة. من القسطرة الأولية للقلب في خطوات 2،2-2،6، إلى التغييرات من حل بين خطوات 2،8-2،14، هناك التلاعب التي يمكن أن تسمح مقدمة من فقاعات الهواء التي حل وسط تدفق سائل الإرو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.