新生儿心脏支架:再生研究新矩阵

摘要

在这些研究中，我们提供了新颖，新生儿，鼠心脏的再生研究使用支架的方法。

摘要

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

引言

心脏衰竭是常见的，致命的。这是一种渐进性疾病，导致心脏，它损害的血液流向内脏和叶身未满足的代谢需求的收缩力下降。据估计，570万美国人患有心脏衰竭和它是住院在美国⁹的首要原因。在美国治疗的患者心脏衰竭的集体费用超过$ 300十亿美元，每年^9-10。对于终末期心脏衰竭，唯一确定的疗法是心脏移植。每年，估计需要在美国^1-2心脏移植程序超过10万个捐助者的心。由于捐助者的数量有限，只有约2,400个移植每年在美国²执行。显然，这个器官短缺需要其他的策略时需出示了transplanta额外的器官加以解决化，理想的是这些器官是自体的，以避免与排斥和寿命免疫抑制有关的并发症。

哺乳动物的成年心肌细胞表现出在损伤有限再生能力，但最近的证据表明哺乳动物新生儿心脏维持损伤后^5-8显着的再生能力。具体地讲，下面的部分的手术切除，再生窗口已被生产后天之间发现7.该再生周期的特征是缺乏纤维化瘢痕，形成新血管形成的，从心外膜血管生成因子的释放，和心肌细胞增殖^{5-8 ，11。}这个再生的时间窗口提供了使用新生儿心脏作为材料的生物人工心脏的发展了一种新的源的电位。

细胞外基质是已知的以提供重要的线索以促进cardiomyocytË增殖和生长。在新生儿和成人的矩阵¹²和促进再生能力的分子的可用性明显的差异已探索^13。脱细胞成人基质已在几个研究中用于提供蜂窝复育的ECM支架和生物人工心脏的产生。虽然这些研究，并在干细胞技术的新的发现，正在迅速推进，几个障碍尚未得到满足。例如，在维护基质的天然结构，蜂窝融入矩阵壁的限制，并能够支持增殖和生长都限制了这种方法的成功。而优异的再生属性已被归因于新生儿心脏，使用这样的组织的实际方面限制了它的探索。

根据新生儿心脏的证明再生能力，我们通过开发一个新的发展矩阵脱细胞为P3小鼠心脏的技术。之所以选择这些研究的P3心脏，因为它是心肌再生的窗口内，先前确定的^6，但心脏够大丰收，decellularize和recellularize。这项研究的目的是证明创建从新生小鼠心脏的矩阵的可行性。我们的研究为脱细胞一分钟，新生儿心脏同时维持ECM的结构和蛋白质的完整性的可行性提供了证据。我们也展示给recellularize与mCherry表达心肌这种心脏ECM的能力，我们已经研究这些心肌细胞为以下recellularization各种心脏标志物的表达。该技术将允许用于生物人工心脏的发展新生儿矩阵的优越性的测试。

研究方案

所有小鼠实验按照美国动物福利法进行，明尼苏达大学的机构动物护理和使用委员会批准。

1.小鼠心脏提取方法

1. 安乐死断头一个新生小鼠用单次使用的刀片。
2. 擦拭用70％乙醇的胸部。
3. 通过削减它远离胸壁与标准的剪刀，而与一对＃5镊子横向拉扯皮肤解剖从胸部皮肤。
4. 穿孔腹部只是不如与由通过腹壁切割剪刀胸骨。抓剑突与＃5镊子，从主体吻侧缩回胸骨切割时虽然肋上用剪刀胸部的两侧。肋骨体现优用钳揭示心脏。
5. 通过用＃5钳侧向拉动直截了当地解剖胸腺两个主瓣，露出在主动脉弓，以及静脉和肺静脉。
6. 从样主动脉弓的主要动脉和主动脉本身，与10厘米春风似剪刀。保留心脏的基部和臂动脉之间的主动脉。抓住切断血管的两端加上＃5镊子反映心脏前行，从气管和食管分离出来。
7. 横切肺血管等主脉，由肺和心脏之间切断对心脏两侧与10厘米春风似剪刀。叶脉保持开放提供排水。
8. 从纵隔与＃5镊子取出心脏，抓大血管被切断的末端。放置心脏中含有导尿无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）60毫米培养皿。

2.通过的Langendorff灌注脱细胞方法

1. 预先准备的导管组件。绘制4cm的段PE在一个小酒精火焰50管创造一个更小，更薄的导管。修剪的端部用刀片以满足尺寸（约300微米与约500微米OD的凸缘外径OD） 如图1所示，这将提供从拉每侧的两个对称的导管。
2. 指向管子的切割端入火焰短暂，在凸缘熔化到在薄端的开口。
3. 填充12毫升注射器用PBS，并通过将一个3路活塞的注射器组装导管。添加22克×1针活塞，通过隔膜驱动针。绘制的PE管导管推到针（ 图1）。
4. 灌溉装配的零件用PBS，确保所有气泡已被删除。
5. 插入导管，如上所述，进入分离的心脏的主动脉，不延伸过主动脉瓣和与7-0缝合线的一个连接结扎制备。休息的t凸缘他近侧导管上日领带，使得密封并防止心脏脱落导管。
6. 观察导管倍率下，一边轻轻用灌注含PBS注射器的心脏。保证不存在任何泄漏在系统中，作为潜血液除去组织均匀Blanches的。
7. 放置隔膜进入入口适配器的颈部和通过在玻璃折叠边密封。
8. 附上经管线足够的长度，以产生生成的如图 20所示毫米汞柱压力的柱填充用60毫升1％十二烷基硫酸钠（SDS）在蒸馏水中（DH ₂ O） _的贮存器。 1，计算从基于1毫米汞柱的关系的液柱高度的压力等于1.3595厘米H ₂ O
   注意:SDS是具有刺激性高度絮状粉末。接触，应该避免。使用适当的防护服处理的粉末。
9. 灌注用1％SDS的心脏14小时。心脏就会在外观上没有观察到剩余的组织是半透明的。
10. 冲洗系统到剩余SDS溶液的活塞，用10毫升的dh ₂ O替换灌注用10ml 1％的Triton X-100的心脏（在蒸馏水中稀释的），接着加入10毫升的dh ₂ O，随后60毫升的PBS含有1x青霉素链霉素（青霉素-链霉素）。
11. 在4℃保存在PBS用1X青霉素 - 链霉素的心脏。如果预期交脱细胞的应用需要灌注然后在主动脉中的导管应保持，否则切断缝合领带和取出导管。

3. DNA测定

1. 在50mM氯化钾制备使用200微克/毫升蛋白酶K脱细胞ECM或控制心脏的摘要，2.5mM的MgCl ₂的，在10mM的Tris（pH值8.3）0.45％吐温20。
2. 在搅拌孵育在55℃的组织，直到组织被溶解，一般4-5小时。
3. 定量的匀浆用DNA结合测定^4,11 DNA含量。

4.固定和组织切片

1. 固定在PBS中的4％多聚甲醛脱细胞，recellularized或控制P3心中，在室温下30分钟。
2. 洗PBS 3倍的组织。
3. 放置在7.5％的蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液中的溶液的组织在4℃下直到它下沉。
4. 改变在0.1M磷酸盐缓冲溶液至15％的蔗糖，4℃，再次，直到它下沉。
5. 暖组织至37℃，用15％的蔗糖和0.1M磷酸盐缓冲明胶溶液更换一半体积的和平衡过夜。明胶的浓度通过1％，2.5％，5％逐步增加，最后7.5％的两倍。
6. 放置在样品中使用新鲜的7.5％明胶cryomolds。用来恢复脱细胞样品的形状，液体的明胶可以灌注到腔室中为t他心中成型。通过浮动cryomolds液氮冷冻。存储在-80℃。
7. 切口（10微米厚）的部分与低温恒温器。带来接近部表面滑动，并观察部关闭从刀在表面上移动，由于在静电处理幻灯片的电荷。隔夜干的幻灯片，并在-80℃，供日后分析存储。
8. 从冰箱中取出幻灯片，平衡至室温，然后放置在含PBS中20分钟，在37℃以溶解明胶一个科普林缸。
9. 从步骤4.7与HE染色切段。广场幻灯片在科普林罐子。暴露在步骤4.8水合苏木45秒的幻灯片，自来水1.5分钟，缓冲液3分钟，自来水1分钟，上蓝剂，1.5分钟，80％乙醇1分钟，酒精曙红Y为8秒， 80％乙醇1分钟，100％乙醇1分钟2倍，清除剂（二甲苯替代品），持续1分钟3次，盖玻片用树脂根据安装中。显微镜检查的幻灯片。
10. 以通过将水合玻片在加湿室中确认心脏ECM，染色为ECM结构蛋白例如胶原IV的ECM蛋白的反应性的保持和在磷酸盐缓冲盐水，用10％正常驴血清（NDS）治疗用0.1％的Triton -X100（PBST）在室温下（RT）1小时。使用足够体积，以覆盖组织切片。
11. 在5％NDS / PBST中的经验确定的稀释替换所选择的初级抗体溶液中。例如，IV型胶原蛋白抗体稀释为1:150。在4℃孵育过夜。
12. 洗用PBST 3倍的幻灯片和应用用荧光染料缀合的选择的次级抗体。由经验确定量稀释抗体。在室温下孵育1小时。用PBS洗3倍。
13. 染色与DNA结合染料的幻灯片如DAPI通过使用含DAPI mounti验证没有细胞核的纳克媒体时滑倒盖的幻灯片。
14. 检查，在50至400倍的荧光显微镜的幻灯片。

5. P1新生儿鼠心肌细胞的Recellularization

1. 喷用70％乙醇各小狗，并用单次使用的刀片斩首。
2. 持在拇指和食指之间的每个小狗而胸腔在含有小无菌剪刀中线分开以暴露胸腔。施加压力，以使心脏，同时它是免费的大血管，并只留下心室组织心房削减从胸部凸出自如。
3. 直接将每个心脏到含20毫升冰冷的钙，碳酸氢游离Hank氏用20mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪直到收集所有的心酸（CBFHH）缓冲盐溶液的50ml管中。
4. 吸出CBFHH并加入10-15毫升新鲜CBFHH（冰冷）到管。纷飞在T组织洗净组织他管好几次。
5. 倒出含有的心，60毫米的塑料培养皿的解决方案。
6. 通过调整它与弹簧剪刀的心中远离从解剖的心中潜伏的任何心房组织倍率下冰。剁碎了心室成均匀大小的小块。取下菜＃5镊子分离的任何非脑室组织。
7. 吸管尽可能多的CBFHH溶液是需要的组织碎片转移到含有无菌微搅拌棒的小的无菌小瓶。
8. 允许所述组织以沉淀到小瓶的底部和取出CBFHH溶液。
9. 使上涨50毫升CBFHH的酶溶液1.75毫克/毫升胰蛋白酶，20微克/毫升DNA酶II的。吸管5毫升此酶溶液并将其添加到含有在磁力搅拌器剁碎心室组织和地点的管。搅拌在室温下以恒定的速率（340转）为8分钟。
   注:搅拌动作要轻柔，但允许用于悬浮液中的淤浆。
10. 除去从搅拌盘的小瓶中，并允许浆料沉降3分钟。吸管并丢弃初始消化上清液，因为它主要包含血细胞和组织碎片。
11. 吸管酶溶液的第二个5毫升一份，并把它添加到消化心室。搅拌8分钟，并允许其沉降另外3分钟。之前开始消化，制备两个50毫升管（标记为1和2），每个含有12毫升冰冷的胎牛血清（FBS）。放置一个40微米的细胞过滤各管之上。吸取上清通过管1过滤器。
12. 重复该消化过程的附加的8倍，交替含有FBS的两个管之间的消化上清液的位置。平分管1和2之间的最后的上清液，以确保在每个管等体积。
    注意:每个采集管现在将包含32.5毫升细胞悬液总体积。
13. 离心管含有ING上清液150 xg离心6分钟，4℃。
14. 同时收集消化的等分试样，制备个100毫米的组织培养板6（含10％FBS，1×青霉素 - 链霉素，1×L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM））每板毫升介质。在37℃，5％CO ₂孵育这些等分试样进行30分钟至平衡介质。
15. 吸出CBFHH酶混合物和重悬细胞到30毫升培养介质的上述制备中，细胞来自收集管结合。
16. 回线的6 ml的细胞悬液，以每100mm的板，并在37°C孵育45分钟。
17. 在温育结束时，非贴壁细胞转移到5个新菜肴和重新孵育45分钟（成纤维细胞馏分已经开始粘附到菜肴和如果需要的话，可以单独生长出）。
18. 在第二轮预镀的结束时，收集来自菜媒体和非贴壁细胞，并在150旋媒体xg离心6分钟。
19. 抽出多余的介质带来的细胞的近似所需的浓度，（每个构建体4.0×10 ^5个细胞在100μl灌注液）。删除计数和生存能力或测试¹⁴等份。

6. P3心矩阵的生物反应器Recellularization

1. 加入细胞前一夜预处理与文化传媒（见步骤5.15），离体心脏矩阵。
2. 组装的Langendorff系统的元件， 如图。 2，高压灭菌玻璃部件和环氧乙烷消毒的塑料零件，以确保无菌。该系统的各个子单元可以在一个层流罩被安装在支撑支架之前进行组装。循环水浴中并加热水流路已为清楚起见被省略。
3. 填用120ml组织培养基的装配系统（见步骤5.15）。
4. 广场步骤2.14心脏导管插入基质60毫米的小路在放大下TURE培养皿并用22克×1针从步骤5.20到导管装有细胞悬液连接1ml注射器。确保本次大会没有气泡，以避免栓塞的心脏。
5. 轻轻地灌注到100微升细胞悬液通过进入冠状动脉的心脏矩阵。完成后，取下注射器/针的组合。
   注:约的缓慢灌注。 20微升每分钟是必需的，以防止细胞从流出静脉，过境心脏。
6. 随着固定在生物反应器心脏瓶盖底部的鲁尔配件的22克钝存根，推到导管存根。
7. 启动蠕动泵，并通过穿过气泡阱泵放置在主动脉在步骤2.5的导管（在图2红路径）观察流程进入如图2中所概述。从贮存流前进。观察出静脉的心脏循环的流动S和滴水从顶点，循环媒体水库。
   注:灌注流量取决于个人因素，如构建物的血管阻力，和心脏的大小，但在50〜100微升/分钟的速度是一个很好的起点。在中间时间点，功能评估可以被执行。新生儿recellularized心脏的大小规模限制了评估，可以进行，但我们已经确定，基于光学的系统可以用来量化打浆行为就像他们在成年大鼠心脏中使用⁴的构建体可以被灌注扩展的时间周期（长达23小时）。

结果

脱细胞
平均而言，时间使用这个协议的P3心脏的脱细胞大约为14小时。给出的平均心脏重量的23毫克为P3新生儿。

Acellularity
图3a说明了一个完全完好P3新生儿心脏（整装）。 图3b示出以下脱细胞相同的心脏; 图4a和4b分别显示了完整和脱细胞的心脏的苏木精和曙红染色?...

讨论

这种技术对心脏的重复灌注的依赖使得栓塞的回避取得成果的一个重要组成部分。从心脏在步骤2.2-2.6初始导尿，到步骤2.8-2.14之间溶液的变化，有操作，可以允许引入气泡而妥协灌注液流入心肌的。由于新生儿心脏的面积小，在血管甚至微小气泡可引起心肌梗死的技术，从而使脱细胞不完整的。另外，在以后的洗涤步骤中，不完整的灌注可导致洗涤剂残留有负面影响的生物相容性。此外，如在步?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.