Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

Riepilogo

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è comune e mortale. È una malattia progressiva che si traduce in una riduzione della contrattilità del cuore, che ostacola il flusso di sangue agli organi e lascia le richieste metaboliche del corpo insoddisfatte. Si stima che 5,7 milioni di americani hanno l'insufficienza cardiaca ed è la causa primaria di ospedalizzazione negli Stati Uniti ^9. Il costo collettivo di trattamento di pazienti in insufficienza cardiaca negli Stati Uniti supera i $ 300 miliardi di dollari l'anno ^9-10. L'unica terapia definitiva per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale è il trapianto di cuore ortotopico. Ogni anno, si stima che più di 100.000 cuori dei donatori sono necessari per le procedure di trapianto cardiaco negli Stati Uniti ^1-2. A causa del limitato numero di donatori, solo circa 2.400 trapianti vengono effettuati ogni anno negli Stati Uniti ^2. Chiaramente, questa carenza di organi deve essere affrontato come altre strategie sono tenuti a produrre organi aggiuntivi per il trapiantozione e, idealmente, questi organi sarebbe autologo in modo da evitare le complicazioni associate con il rifiuto e la durata immunosoppressione.

Cardiomiociti adulti mammiferi dimostrano una limitata capacità di rigenerazione su di infortunio, ma recenti evidenze suggeriscono che mammiferi cuori neonatali mantengono una notevole capacità rigenerativa dopo un trauma ^5-8. In particolare, dopo la resezione chirurgica parziale, una finestra rigenerativa è stato scoperto tra la nascita e postnatale giorno 7. Questo periodo rigenerativa è caratterizzata da una mancanza di cicatrice fibrotica, formazione di neovascolarizzazione, rilascio di fattori angiogenici dalla epicardio e cardiomiociti proliferazione ^{5-8 , 11.} Questa finestra rigenerativo di tempo fornisce il potenziale di utilizzo cuore neonatale quale nuovo fonte di materiale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.

La matrice extracellulare è nota per fornire spunti importanti per promuovere cardiomyocyte la proliferazione e la crescita. Chiare differenze nella disponibilità di molecole nelle matrici neonatali e adulti ¹² e la loro capacità di promuovere la rigenerazione sono state esplorate ^13. matrici adulti decellularized sono stati utilizzati in diversi studi per fornire un ponteggio ECM per ripopolazione cellulare e la generazione di un cuore bioartificiale. Mentre questi studi, e le nuove scoperte nel campo delle tecnologie di cellule staminali, stanno avanzando rapidamente, diversi ostacoli devono ancora essere soddisfatte. Ad esempio, limitazioni nella preservando la struttura originaria della matrice, l'integrazione cellulare nella parete della matrice, e la capacità di sostenere la proliferazione e la crescita tutti i limiti del successo di questo approccio. Mentre gli attributi rigenerativa superiori sono state attribuite al cuore neonatale, gli aspetti pratici di utilizzo di un tessuto così hanno limitato la sua esplorazione.

Sulla base della capacità rigenerativa dimostrata del cuore neonatale, abbiamo sviluppato nuovi matrici sviluppando unatecnica di decellularization per il cuore P3 mouse. Il cuore P3 è stato scelto per questi studi in quanto è all'interno della finestra di rigenerazione cardiaca come precedentemente determinato ⁶ ma il cuore è grande abbastanza per il raccolto, decellularize e recellularize. L'obiettivo di questo studio è quello di dimostrare la fattibilità della creazione di una matrice da un cuore neonatale del mouse. I nostri studi forniscono prove per la fattibilità di decellularizing un minuto, cuore neonatale pur mantenendo l'integrità strutturale e proteica della ECM. Dimostriamo anche la capacità di recellularize questo ECM cardiaco con mCherry cardiomiociti che esprimono e abbiamo esaminato questi cardiomiociti per l'espressione di diversi marcatori cardiaci seguenti Recellularization. Questa tecnologia permetterà per la prova della superiorità di una matrice neonatale per lo sviluppo di un cuore bioartificiale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti di topo sono stati eseguiti in conformità con Animal Welfare Act degli Stati Uniti e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università del Minnesota.

1. Metodo per l'isolamento Cuore mouse

1. Euthanize un mouse neonatale per decapitazione con una sola lama utilizzo.
2. Tampone torace con il 70% di etanolo.
3. Sezionare la pelle dal petto tagliando via dalla parete toracica con le forbici standard, tirando la pelle lateralmente una coppia di pinze # 5.
4. Perforare l'addome appena inferiore allo sterno con le forbici tagliando attraverso la parete addominale. Afferrando il processo xifoideo con # 5 pinze, ritrarre lo sterno rostralmente dal corpo durante il taglio se le costole su entrambi i lati del torace con le forbici. La gabbia toracica si riflette superiormente con la pinza per rivelare il cuore.
5. Senza mezzi termini sezionare i due lobi principali del timo tirando lateralmente # 5 pinze, esponendol'arco dell'aorta, nonché le vene cavali e polmonari.
6. Transetto le principali arterie dall'arco aortico e l'aorta in sé, con le forbici a molla 10 cm. Conservare l'aorta tra la base del cuore e l'arteria anonima. Afferrare le estremità dei vasi mozzate con il # 5 pinze per riflettere cuore avanti, separandolo dalla trachea e dell'esofago.
7. Transect vascolare polmonare e altre grandi vene, tagliando tra i polmoni e il cuore su entrambi i lati del cuore con le forbici a molla 10 cm. Le vene rimangono aperti per fornire il drenaggio.
8. Rimuovere il cuore dal mediastino con il # 5 pinze, afferrare le estremità mozzate dei grandi vasi. Mettere il cuore in un piatto di cultura 60 millimetri contenente sterile tampone fosfato salino (PBS) per cateterizzazione.

2. Metodo per Decellularization da Langendorff perfusione

1. Preparare il complesso di catetere in anticipo. Disegnare una sezione di quattro centimetriPE 50 tubi in una piccola fiamma alcool per creare un più piccolo, più sottile catetere. Tagliare le estremità con una lama per soddisfare le dimensioni (circa. 300 um OD diametro esterno di una flangia di circa. OD 500 micron) di figura 1. Ciò fornirà due cateteri simmetriche da ciascun lato del tiro.
2. Puntare l'estremità tagliata del tubo nella fiamma brevemente, per fondere una flangia sulla apertura all'estremità sottile.
3. Riempire la siringa 12 ml con PBS e assemblare il catetere inserendo un rubinetto a 3 vie sulla siringa. Aggiungere un 22 G x 1 ago per il rubinetto e guidare l'ago attraverso il setto. Far scorrere il tubo del catetere PE disegnato sul dell'ago (Fig. 1).
4. Lavare le parti assemblate con PBS, assicurando che tutte le bolle d'aria sono stati rimossi.
5. Inserire il catetere, preparato come descritto sopra, in aorta del cuore isolato, che non si estende oltre la valvola aortica e legare con un tirante di 7-0 sutura. Appoggiare la flangia di tegli catetere prossimale contro la cravatta, facendo una perfetta tenuta e prevenire il cuore di venire fuori il catetere.
6. Osservare la cateterizzazione sotto ingrandimento, mentre delicatamente perfusione cuore utilizzando la siringa contenente PBS. Assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema e il tessuto blanches omogeneo come il sangue latente viene rimosso.
7. Posizionare il setto nel collo dell'adattatore ingresso e sigillarlo ripiegando i lati sopra il vetro.
8. Fissare il serbatoio riempito con 60 ml di 1% solfato di sodio dodecil (SDS) in acqua distillata (DH ₂ O) tramite una linea di lunghezza sufficiente a produrre una colonna che genera 20 millimetri Hg di pressione, come mostrato in Fig. 1. Calcolare la pressione dall'alto colonna di liquido in base al rapporto di 1 mm Hg è pari a 1,3595 centimetri H ₂ O.
   Attenzione: SDS è una polvere altamente flocculante con proprietà irritanti. Contatto dovrebbe essere evitato. Maneggiare la polvere utilizzando appropriati indumenti protettivi.
9. Profumato cuore con 1% SDS per 14 ore. Il cuore sarà traslucido in apparenza senza tessuto rimanente osservabile.
10. Lavare il sistema fino al rubinetto della soluzione rimanente SDS e sostituirla con 10 ml dH ₂ O. Profumato cuore con 10 ml di 1% Triton X-100 (diluito in acqua distillata), seguita da 10 ml dH ₂ O, seguiti da 60 ml di PBS contenenti 1x streptomicina penicillina (Pen-Strep).
11. Conservare il cuore in PBS con 1x Pen-Strep a 4 ° C. Se l'applicazione palo decellularization destinato richiede perfusione quindi il catetere in aorta deve essere mantenuto, altrimenti tagliare il legame di sutura e rimuovere il catetere.

Determinazione 3. DNA

1. Preparare un digest del decellularized ECM o il controllo cardiaco utilizzando 200 mg / ml proteinasi K in 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl _2, 0,45% di Tween 20 in 10 mM Tris (pH 8,3).
2. Incubare il tessuto a 55 ° C con agitazione fino a quando il tessuto è dissolto,in genere 4-5 ore.
3. Quantificare il contenuto di DNA della omogenato con un DNA test di ^4,11 vincolante.

4. Fissazione e il sezionamento di tessuto

1. Fix decellularized, cuori recellularized o controllo P3 in 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare il tessuto in PBS 3x.
3. Posizionare il tessuto in una soluzione di 7,5% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C fino affonda.
4. Cambiare la soluzione al 15% di saccarosio in tampone fosfato 0,1 M a 4 ° C, ancora, fino affonda.
5. Riscaldare il tessuto a 37 ° C, sostituire la metà del volume con soluzione di gelatina nel 15% di saccarosio e 0,1 M tampone fosfato ed equilibrare la notte. Le concentrazioni di gelatina sono aumentati graduale attraverso 1%, 2,5%, 5% e infine 7,5% due volte.
6. Mettere i campioni in cryomolds utilizzando fresco 7,5% di gelatina. Per ripristinare la forma dei campioni decellularized, liquido gelatina può essere perfuso nelle camere come tlui cuori sono modellati. Congelare galleggiando i cryomolds in azoto liquido. Conservare a -80 ° C.
7. CUT (10 micron di spessore) sezioni con un criostato. Portare la slitta vicino alla superficie della sezione e osservare la sezione spostarsi fuori dal coltello sulla superficie dovuta alla carica sui vetrini trattati elettrostaticamente. Asciugare le diapositive durante la notte e conservare a -80 ° C per le analisi future.
8. Rimuovere i vetrini dal congelatore, equilibrare a temperatura ambiente e poi posto in una vaschetta Coplin contenente PBS per 20 minuti a 37 ° C per sciogliere la gelatina.
9. Macchiare le sezioni tagliate dal punto 4.7 con ematossilina eosina. Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin. Esporre le diapositive idratato al punto 4.8 per ematossilina per 45 secondi, l'acqua del rubinetto per 1,5 minuti, tampone per 3 minuti, l'acqua del rubinetto per 1 minuto, agente azzurrante per 1,5 min, 80% di etanolo per 1 min, alcolica Eosina Y per 8 secondi, 80% di etanolo per 1 minuto, 100% di etanolo per 1 min 2x, stanza di compensazione (sostituto di xilene) per 1 min 3x, coprioggetto con resinaMezzo di montaggio basato. Esaminare le diapositive al microscopio.
10. Per confermare il mantenimento di ECM proteine ​​reattività del ECM cuore, macchia per proteine ​​strutturali ECM come il collagene IV, ponendo le diapositive idratati in una camera umidificata e trattare con il 10% normale asino siero (NDS) in tampone fosfato con 0,1% Triton -X100 (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Utilizzare un volume sufficiente a coprire le sezioni di tessuto.
11. Sostituire la soluzione con l'anticorpo primario di scelta ad una diluizione empiricamente determinato 5% NDS / PBST. Per esempio, l'anticorpo collagene IV è stato diluito a 1: 150. Incubare per una notte a 4 ° C.
12. Lavare i vetrini con PBST 3x e applicare un anticorpo secondario di scelta coniugato con un colorante fluorescente. Diluire l'anticorpo di una quantità determinata empiricamente. Incubare per 1 ora a RT. Lavare con PBS 3x.
13. Colorare i vetrini con un colorante legame al DNA come DAPI per verificare l'assenza di nuclei delle cellule utilizzando un mounti DAPI contenenteng media quando il coperchio scivolare le diapositive.
14. Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza da 50 a 400X.

5. P1 neonatale murino ventricolare cardiomiociti per Recellularization

1. Spruzzare ogni cucciolo con il 70% di etanolo e decapitarlo con una lama singola uso.
2. Tenere ogni pup tra il pollice e l'indice, mentre il torace è diviso sulla linea mediana con piccole forbici sterili per esporre la cavità toracica. Applicare pressione per consentire cuore di sporgere liberamente dal petto mentre è tagliato libera dei grandi vasi e gli atri lasciando solo il tessuto ventricolare.
3. Mettere ogni cuore direttamente in un tubo da 50 ml contenente 20 ml ghiacciata di calcio, soluzione salina tamponata Bicarbonato libero di Hank con 20 mM 4- (2-idrossietil) Acido -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) fino a quando tutti i cuori sono raccolti.
4. Aspirare il CBFHH e aggiungere 10-15 ml di CBFHH fresco (ghiacciata) al tubo. Lavare il tessuto agitando il tessuto in tegli provetta diverse volte.
5. Decantare la soluzione contenente il cuore in una plastica Petri piastre da 60 mm.
6. Sezionare qualsiasi tessuto atriale latente dal cuore sotto ingrandimento sul ghiaccio da tagliare via dal cuore con le forbici a molla. Tritare i ventricoli in piccoli pezzi in modo omogeneo dimensioni. Rimuovere qualsiasi tessuto non-ventricolare separato dal piatto con # 5 pinze.
7. Pipettare tanto della soluzione CBFHH come è necessario per trasferire i frammenti di tessuto in una piccola fiala sterile contenente una sterile bar micro mescolare.
8. Lasciare il tessuto sedimentare sul fondo della fiala e rimuovere la soluzione CBFHH.
9. Portare 50 ml di una soluzione enzimatica 1,75 mg / ml di tripsina, 20 ug / ml DNasi II in CBFHH. Dispensare 5 ml di questa soluzione enzimatica e aggiungerlo a una provetta contenente il tessuto ventricolare tritato e posto su un agitatore magnetico. Mescolare ad un tasso costante (340 rpm) a temperatura ambiente per 8 min.
   NOTA: L'azione di agitazione deve essere dolce e tuttavia consentireper la sospensione della sospensione.
10. Rimuovere la fiala dalla piastra mescolare e lasciare l'impasto per sedimentare per 3 min. Pipetta e scartare il surnatante iniziale di digerire, in quanto contiene principalmente le cellule del sangue e detriti dei tessuti.
11. Pipettare un secondo 5 ml aliquota della soluzione enzimatica e aggiungerlo al ventricolo digerire. Mescolare per 8 minuti e lasciare sedimentare per altri 3 minuti. Prima di iniziare i digest, preparare due provette da 50 ml (etichettati 1 e 2) ciascuna contenente 12 ml di ghiacciata siero fetale bovino (FBS). Mettere un filtro cella di 40 micron in cima a ciascun tubo. Pipettare questo surnatante attraverso il filtro sul tubo 1.
12. Ripetere il processo di digestione ulteriori 8 volte, alternando il posizionamento del surnatante digest tra i due tubi contenenti FBS. Dividere l'ultimo surnatante in parti uguali tra i tubi 1 e 2 per garantire volumi uguali in ogni tubo.
    NOTA: Ogni tubo di raccolta conterrà ora 32,5 ml di volume totale di sospensione cellulare.
13. Centrifugare le provette contengonoing XG surnatante 150 per 6 minuti a 4 ° C.
14. Mentre la raccolta delle aliquote di digestione, preparare cinque 100 piastre di coltura dei tessuti mm con 6 ml di media (Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) con il 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutammina) per piastra. Incubare le aliquote a 37 ° C, 5% CO ₂ per 30 minuti per equilibrare la media.
15. Aspirare la miscela di enzimi CBFHH e risospendere le cellule in 30 ml di terreni di coltura preparato in precedenza, che unisce le cellule da entrambi i tubi di raccolta.
16. Ritorno 6 ml di sospensione cellulare per ciascuna delle piastre 100 mm e incubare per 45 min a 37 ° C.
17. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule non aderenti a 5 piatti nuovi e ri-incubare per 45 min (la frazione fibroblasti avrà iniziato ad aderire ai piatti e può essere coltivata separatamente se desiderato).
18. Al termine del secondo turno di pre-placcatura, raccogliere i media e le cellule non aderenti dai piatti e far girare i mezzi di comunicazione a 150xg per 6 min.
19. Aspirare supporti in eccesso per portare le cellule alla concentrazione desiderata approssimativa, (4.0 x 10 ⁵ cellule per costrutto in 100 ml di perfusato). Rimuovere una aliquota per il conteggio e la vitalità o il test di ^14.

6. bioreattore Recellularization di P3 Cuore Matrix

1. Pretrattare la matrice cuore isolato con terreni di coltura (vedi punto 5.15) per una notte prima di aggiungere le cellule.
2. Assemblare gli elementi di un sistema di Langendorff come mostrato in Fig. 2. Autoclave le parti in vetro e ossido di etilene sterilizzare le parti in plastica per assicurare la sterilità. Varie unità secondarie del sistema possono essere assemblati in una cappa a flusso laminare prima di essere montato sul supporto. Di circolazione bagno di acqua e riscaldata percorso del flusso d'acqua è stato omesso per chiarezza.
3. Riempire il sistema assemblato con 120 ml di terreni di coltura tissutale (vedere il punto 5.15).
4. Posizionare la matrice cuore cateterismo dal punto 2.14 in un cul 60 millimetripiatto tura sotto ingrandimento e collegare una siringa da 1 ml con 22 G x 1 ago caricato con sospensione cellulare dal punto 5.20 al catetere. Assicurarsi che questa assemblea è privo di bolle d'aria per evitare embolizzazione cuore.
5. profumato delicatamente i 100 ml di sospensione cellulare nella matrice cuore attraverso le arterie coronarie. Una volta completato, staccare la combinazione della siringa / ago.
   NOTA: Un lento perfusione di circa mq. 20 ml per min è necessaria per evitare che le cellule di fluire fuori dalle vene, in transito cuore.
6. Con un 22g stub smussato fissato al raccordo Luer sul lato inferiore del coperchio vaso cuore bioreattore, spingere il catetere sul perno.
7. Avviare la pompa peristaltica e osservare che il flusso procede come illustrato in figura 2. Flusso procede dal serbatoio tramite la pompa attraverso il gorgogliatore al catetere posizionato in aorta nel passo 2.5 (percorso rosso in Fig. 2). Osservare il flusso della circolazione cardiaco della venas e gocciolare dall'apice, ricircolo al serbatoio media.
   NOTA: La portata perfusione dipende da fattori individuali quali la resistenza vascolare del costrutto, e la dimensione del cuore, ma un tasso di 50 a 100 microlitri / min è un buon punto di partenza. In momenti intermedi, le valutazioni funzionali possono essere eseguiti. La scala dimensione del cuore recellularized neonatale limita le valutazioni, che possono essere eseguite, ma abbiamo stabilito che i sistemi basati otticamente possono essere utilizzati per quantificare battere comportamento così come sono stati utilizzati in cuori di ratto adulto. ⁴ Il costrutto può essere perfusi per esteso periodi di tempo (fino a 23 ore).

Risultati

decellularization
In media, il tempo di decellularization di un cuore P3 utilizzando questo protocollo è di circa 14 ore. dato un peso medio di 23 mg di cuore per il neonato P3.

Acellularity
Figura 3a mostra un cuore neonatale completamente intatto P3 (tutto il monte). La figura 3b mostra lo stesso cuore seguente decellularization. Figure 4a e 4b

Discussione

La dipendenza di questa tecnica su ripetuto perfusione del cuore fa evitare un'embolia una componente critica di un esito positivo. Dal cateterizzazione iniziale del cuore nei passaggi 2.2-2.6, ai cambiamenti di soluzione tra Piazza 2.8-2.14, ci sono manipolazioni che possono permettere l'introduzione di bolle d'aria che compromettono il flusso di perfusato nel miocardio. A causa del peso ridotto cuore neonatale, anche bolle minute vascolarizzazione possono causare un infarto tecnica, rendendo il decellulari...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.