Néonatale cardiaque Echafaudages: Matrices nouveaux pour Études régénératives

Résumé

Dans ces études, nous fournissons une méthodologie pour de nouvelles, échafauds cardiaques néonatales, murins pour une utilisation dans les études de régénération.

Résumé

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

L'insuffisance cardiaque est fréquente et mortelle. Il est une maladie progressive qui se traduit par une diminution de la contractilité du coeur, ce qui altère le flux sanguin vers les organes et laisse les besoins métaboliques de la non satisfaite du corps. On estime que 5,7 millions d' Américains ont une insuffisance cardiaque et il est la principale cause d'hospitalisation aux États-Unis ^9. Le coût collectif de traitement des patients en insuffisance cardiaque aux États-Unis dépasse les 300 milliards de dollars par an ^9-10. Le seul traitement définitif de l'insuffisance cardiaque au stade terminal est une greffe cardiaque orthotopique. Chaque année, on estime que plus de 100.000 coeurs donateurs sont nécessaires pour les procédures de transplantation cardiaque aux États-Unis ^1-2. En raison du nombre limité de donateurs, seuls environ 2.400 transplantations sont réalisées chaque année aux États - Unis ^2. De toute évidence, cette pénurie d'organes doit être abordée que d'autres stratégies sont nécessaires pour produire des organes supplémentaires pour transplantationtion et, idéalement, ces organes seraient autologue de manière à éviter les complications associées au rejet et de la durée de vie immunosuppression.

Cardiomyocytes adultes Mammifères démontrent une capacité de régénération limitée sur blessure , mais des données récentes suggèrent que les cœurs néonatals mammifères maintiennent une capacité de régénération remarquable suite à une lésion ^5-8. Plus précisément, après une résection chirurgicale partielle, une fenêtre de régénération a été découverte entre la naissance et le jour post - natal 7. Cette période de régénération se caractérise par une absence de cicatrice fibrotique, la formation de la néovascularisation, la libération de facteurs angiogéniques , de l'épicarde, et la prolifération des cardiomyocytes ^{8/5 , 11.} Cette fenêtre de régénération du temps fournit la possibilité d'utiliser le cœur du nouveau-né comme une nouvelle source de matériel pour le développement d'un cœur bioartificiel.

La matrice extracellulaire est connu pour fournir des indices importants pour promouvoir cardiomyocyte prolifération et la croissance. Différences distinctes dans la disponibilité des molécules dans les matrices néonatales et adultes ¹² et leur capacité à promouvoir la régénération ont été explorées ^13. les matrices adultes décellularisés ont été utilisées dans plusieurs études pour fournir un échafaudage de l'ECM pour la repopulation cellulaire et la génération d'un coeur bioartificiel. Bien que ces études, et de nouvelles découvertes dans les technologies de cellules souches, progressent rapidement, plusieurs obstacles doivent encore être remplies. Par exemple, les limitations dans la préservation de la structure native de la matrice, l'intégration cellulaire dans la paroi de la matrice, et la capacité de soutenir la prolifération et à la croissance de toute limite le succès de cette approche. Alors que les attributs de régénération supérieures ont été attribuées au cœur du nouveau-né, les aspects pratiques de l'utilisation d'un tel tissu ont limité son exploration.

Sur la base de la capacité de régénération démontré du cœur néonatale, nous avons développé de nouvelles matrices en développant unetechnique de décellularisation pour le coeur P3 de la souris. Le cœur P3 a été choisi pour ces études car il est dans la fenêtre de régénération cardiaque comme précédemment déterminé ⁶ mais le cœur est assez grand pour la récolte, decellularize et recellularize. Le but de cette étude est de démontrer la faisabilité de la création d'une matrice à partir d'un cœur de souris néonatale. Nos études fournissent des preuves de la faisabilité de décellularisation d'une minute, le cœur du nouveau-né, tout en maintenant l'intégrité structurelle et protéinique de l'ECM. Nous démontrons également la capacité de recellularize cette ECM cardiaque avec mCherry cardiomyocytes exprimant et nous avons examiné ces cardiomyocytes pour l'expression de différents marqueurs cardiaques suivants recellularization. Cette technologie permet à l'essai de la supériorité d'une matrice du nouveau-né à l'élaboration d'un coeur bioartificiel.

Protocole

Toutes les expériences de souris ont été effectuées en conformité avec loi sur la protection des animaux et des États-Unis ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université du Minnesota.

1. Méthode de coeur Souris Isolation

1. Euthanasier une souris néonatale par décapitation avec une lame à usage unique.
2. Badigeonner le thorax avec 70% d'éthanol.
3. Disséquer la peau de la poitrine en réduisant l'écart de la paroi thoracique, avec des ciseaux standards tout en tirant la peau latéralement par une paire de pinces # 5.
4. Perforer l'abdomen juste en dessous du sternum avec les ciseaux en coupant à travers la paroi abdominale. Saisissant le processus xiphoïde avec # 5 forceps, rétracter le sternum rostrale du corps pendant la coupe que les nervures de chaque côté de la poitrine avec les ciseaux. La cage thoracique est réfléchie supérieurement avec la pince pour révéler le cœur.
5. disséquer Carrément les deux lobes principaux du thymus en tirant latéralement avec # 5 forceps, exposerla crosse de l'aorte, ainsi que les veines Caval et pulmonaires.
6. Transect les artères principales de la crosse de l'aorte et l'aorte elle-même, avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Maintenir l'aorte entre la base du coeur et l'artère brachiocéphalique. Saisir les extrémités des vaisseaux sectionnés avec le # 5 forceps pour refléter le cœur vers l'avant, la séparant de la trachée et de l'œsophage.
7. Transect la vascularisation pulmonaire et d'autres veines principales, en coupant entre les poumons et le coeur des deux côtés du cœur avec les ciseaux à ressort de 10 cm. Les veines restent ouvertes pour assurer le drainage.
8. Retirer le cœur du médiastin avec les # 5 pinces, saisir les extrémités coupées des grands navires. Placez le coeur dans une boîte de culture de 60 mm contenant du phosphate saline stérile tamponnée (PBS) pour le cathétérisme.

2. Méthode de décellularisation par Langendorff Perfusion

1. Préparer l'ensemble de cathéter à l'avance. Dessiner une section 4 cmPE 50 tube dans une petite flamme d'alcool pour créer un plus petit, plus mince cathéter. Couper les extrémités d'une lame pour atteindre les dimensions (env. 300 um de diamètre extérieur OD avec une bride d'env. 500 um DO) représentée sur la figure 1. Ceci fournira deux cathéters symétriques de chaque côté de la traction.
2. Pointez l'extrémité du tube de coupe dans la flamme brièvement, pour faire fondre une bride sur l'ouverture à l'extrémité mince.
3. Remplir la seringue 12 ml avec du PBS et assembler le cathéter en plaçant un robinet d'arrêt à 3 voies sur la seringue. Ajouter un 22 G x 1 aiguille du robinet et conduire l'aiguille à travers le septum. Faites glisser le PE tube cathéter dessiné sur l'aiguille (Fig. 1).
4. Irriguer les pièces assemblées avec du PBS, assurant que toutes les bulles d'air ont été enlevés.
5. Insérez le cathéter, préparé comme décrit ci-dessus, dans l'aorte du coeur isolé, pas étendant au-delà de la valve aortique et ligaturer avec un match nul de 7-0 suture. Reste la bride de til cathéter à proximalement contre la cravate, ce qui rend un joint étanche et empêchant le cœur de se détacher du cathéter.
6. Observer le cathétérisme sous grossissement, tandis que perfuser doucement le cœur à l'aide de la seringue contenant du PBS. Veiller à ce qu'il n'y ait pas de fuites dans le système et le tissu homogène que le sang blanches latente est retirée.
7. Placer la cloison dans le col de l'adaptateur d'entrée et le sceller en pliant les côtés au-dessus de la vitre.
8. Fixer le réservoir rempli avec 60 ml de 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l' eau distillée (dH ₂ O) par l' intermédiaire d' une ligne de longueur suffisante pour produire une colonne qui génère 20 mm Hg de pression comme indiqué sur la Fig. 1. Calculer la pression de la hauteur de colonne de liquide en fonction de la relation de 1 mm de Hg est égale à 1,3595 cm H ₂ O.
   Attention: SDS est une poudre hautement floculant avec des propriétés irritantes. Le contact doit être évité. Manipulez la poudre en utilisant des vêtements de protection appropriés.
9. Perfuser cœur avec 1% SDS pendant 14 heures. Le cœur sera translucide en apparence sans tissu restant observable.
10. Rincer le système jusqu'à le robinet de la solution SDS restant et le remplacer par 10 ml dH ₂ O. Perfuser le cœur avec 10 ml de 1% de Triton X-100 (dilué dans de l' eau distillée), suivie par 10 ml dH ₂ O, suivie par 60 ml de PBS contenant de la pénicilline streptomycine 1x (Pen-Strep).
11. Rangez le coeur dans du PBS avec 1x Pen-Strep à 4 ° C. Si l'application post-décellularisation destinée nécessite perfusion puis le cathéter dans l'aorte doit être maintenue, sinon couper l'attache de suture et retirer le cathéter.

3. Détermination de l'ADN

1. Préparer un condensé de l'ECM ou le contrôle cardiaque décellularisé utilisant 200 pg / ml de proteinase K dans 50 mM de KCl, 2,5 mM de _MgCl2, 0,45% de Tween 20 dans du Tris 10 mM (pH 8,3).
2. Laisser incuber le tissu à 55 ° C avec agitation jusqu'à ce que le tissu est dissous,généralement 4-5 h.
3. Quantifier la teneur en ADN de l'homogénat avec un dosage de liaison à l' ADN ^4,11.

4. Fixation et Sectionnement des tissus

1. Fix décellularisé, coeurs recellularized ou le contrôle P3 dans 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 30 min à température ambiante.
2. Laver le tissu dans du PBS 3x.
3. Placer le tissu dans une solution de 7,5% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C jusqu'à ce qu'il coule.
4. Modifier la solution à 15% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M à 4 ° C, encore une fois, jusqu'à ce qu'il coule.
5. Chauffer le tissu à 37 ° C, de remplacer la moitié du volume avec une solution de gélatine à 15% de saccharose et 0,1 M de tampon phosphate et équilibrer pendant une nuit. Les concentrations de gélatine sont augmentées par paliers par l'intermédiaire de 1%, 2,5%, 5% et enfin 7,5% deux fois.
6. Placer les échantillons dans cryomoules utilisant fraîche 7,5% de gélatine. Pour restaurer la forme des échantillons décellularisés, liquide gélatine peut être perfusée dans les chambres comme til les cœurs sont moulés. Congeler par flottage cryomoules sur l'azote liquide. Conserver à -80 ° C.
7. Couper (10 um d'épaisseur) sections avec un cryostat. Apportez la lame près de la surface de section et d'observer la section se déplacer hors du couteau sur la surface en raison de la charge sur les lames électrostatiquement traitées. Sécher les diapositives pendant la nuit et stocker à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
8. Retirer les lames du congélateur, équilibrer à température ambiante puis placer dans un bocal de Coplin contenant du PBS pendant 20 min à 37 ° C pour dissoudre la gélatine.
9. Colorer les sections coupées de l'étape 4.7 à l'hématoxyline et de l'éosine. Placer les lames dans une jarre de Coplin. Exposer les diapositives hydratés à l'étape 4.8 à hématoxyline pendant 45 sec, l'eau du robinet pendant 1,5 min, tampon pendant 3 minutes, l'eau du robinet pendant 1 min, agent de bleuissement pendant 1,5 min, l'éthanol 80% pendant 1 min, alcooliques éosine Y pendant 8 sec, éthanol 80% pendant 1 min, l'éthanol à 100% pour 1 min 2x, agent de compensation (remplaçant du xylène) pour 1 min 3x, lamelle avec de la résinemoyen de montage sur la base. Examiner les lames au microscope.
10. Pour confirmer le maintien de l'ECM protéine réactivité de l'ECM cardiaque, une teinture pour ECM des protéines structurales telles que le collagène IV, en plaçant les lames hydratés dans une chambre humidifiée et on traite avec 10% d'âne sérum normal (PDN) dans un tampon phosphate salin à 0,1% de Triton -X100 (PBST) pendant 1 heure à la température ambiante (RT). Utiliser un volume suffisant pour couvrir les coupes de tissu.
11. Remplacer la solution avec l'anticorps primaire de choix à une dilution déterminée empiriquement dans 5% NDS / PBST. Par exemple, l'anticorps de collagène IV a été dilué à 1: 150. Incuber une nuit à 4 ° C.
12. Laver les lames avec du PBST 3x et à appliquer un anticorps secondaire de choix conjugué à un colorant fluorescent. Diluer l'anticorps par une quantité déterminée de manière empirique. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS 3x.
13. Colorer les lames avec un colorant de liaison à l'ADN tels que le DAPI afin de vérifier l'absence de noyaux cellulaires en utilisant un mounti contenant DAPIng moyen lorsque le couvercle de glisser les diapositives.
14. Examiner les lames avec un microscope à fluorescence de 50 à 400X.

5. P1 néonatal murin Ventricular cardiomyocytes pour Recellularization

1. Vaporiser chaque chiot avec 70% d'éthanol et décapite avec une lame à usage unique.
2. Tenir chaque chiot entre le pouce et l'index tandis que le thorax est divisé sur la ligne médiane avec de petits ciseaux stériles pour exposer la cavité thoracique. Appliquer une pression pour permettre au coeur de faire saillie librement de la poitrine alors qu'il est coupé libre des gros vaisseaux et les oreillettes ne laissant que le tissu ventriculaire.
3. Placez chaque coeur directement dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de glace-froid calcium, la solution saline tamponnée de Bicarbonate libre Hank avec mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic 20 (CBFHH) jusqu'à ce que tous les cœurs sont recueillis.
4. Aspirer le CBFHH et ajouter 10-15 ml de CBFHH frais (glacé) au tube. Laver le tissu en faisant tourbillonner le tissu en til le tube plusieurs fois.
5. Décanter la solution contenant les coeurs dans une boîte de Petri en plastique de 60 mm.
6. Disséquer tout tissu auriculaire latente du cœur sous un grossissement sur la glace en rognant loin de les coeurs avec les ciseaux à ressort. Émincer les ventricules en taille homogène petits morceaux. Retirez tout tissu non-ventriculaire séparé du plat avec # 5 forceps.
7. Pipet autant de la solution CBFHH que nécessaire pour transférer les fragments de tissus dans un petit flacon stérile qui contient une barre d'agitation micro stérile.
8. Laisser le tissu dans les sédiments au fond du flacon et retirer la solution CBFHH.
9. Compenser 50 ml d'une solution d'enzyme de 1,75 mg / ml de trypsine, 20 pg / ml de DNase II CBFHH. Pipet 5 ml de cette solution d'enzyme et l'ajouter à un tube contenant du tissu ventriculaire émincé et le placer sur un agitateur magnétique. Agiter à une vitesse constante (340 rpm) à température ambiante pendant 8 min.
   NOTE: L'action d'agitation doit être doux et pourtant permettrela suspension de la suspension.
10. Retirer la cuvette de la plaque d'agitation et de permettre la suspension de sédiments pendant 3 min. Pipeter et jeter le surnageant digérer initiale, car elle contient principalement des cellules sanguines et des débris de tissu.
11. Pipeter une seconde partie aliquote de 5 ml de la solution d'enzyme et l'ajouter au ventricule digestion. Agiter pendant 8 min et laisser sédimenter pendant encore 3 min. Avant de commencer les digestions, préparer deux tubes de 50 ml (marqué 1 et 2) contenant chacun 12 ml glacé sérum de veau fœtal (FBS). Placer un tamis cellulaire de 40 pm au sommet de chaque tube. Pipet ce surnageant à travers le filtre sur le tube 1.
12. Répétez le processus de digestion une 8 fois supplémentaires, en alternant le placement du surnageant de digestion entre les deux tubes contenant du FBS. Divisez le dernier surnageant à parts égales entre les tubes 1 et 2 pour assurer des volumes égaux dans chaque tube.
    NOTE: Chaque tube de collection contient maintenant 32,5 ml volume total de la suspension cellulaire.
13. Centrifuger les tubes contiennentment le surnageant 150 g pendant 6 min à 4 ° C.
14. Lors de la collecte des aliquotes de digestion, préparer cinq 100 tissus mm plaques de culture avec 6 ml de milieu (Modified Eagle Media (DMEM de Dulbecco) avec 10% de FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamine) par plaque. Incuber ces aliquotes à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 30 minutes pour équilibrer les médias.
15. Aspirer le mélange d'enzymes CBFHH et remettre en suspension les cellules dans 30 ml de milieu de culture préparé ci-dessus, en combinant les cellules des deux tubes de prélèvement.
16. Retour 6 ml de suspension cellulaire dans chacune des plaques de 100 mm et incuber pendant 45 min à 37 ° C.
17. A la fin de l'incubation, transférer les cellules non-adhérentes à 5 nouveaux plats et re-incuber pendant 45 minutes (la fraction de fibroblaste aura commencé à adhérer aux plats et peuvent être cultivées séparément si on le souhaite).
18. A la fin du second tour de pré-placage, recueillir les médias et les cellules non-adhérentes de la vaisselle et faire tourner les supports à 150xg pendant 6 min.
19. Soutirer l' excès support pour amener les cellules à la concentration désirée approximative (4,0 x 10 ⁵ cellules par recombinaison dans 100 ul de solution de perfusion). Retirer une aliquote de comptage et ou la viabilité des tests ^14.

6. bioréacteur Recellularization de P3 Coeur Matrice

1. Prétraiter la matrice de coeur isolé avec des milieux de culture (voir l'étape 5.15) pendant la nuit avant d'ajouter les cellules.
2. Assembler les éléments d'un système Langendorff comme représenté sur la Fig. 2. Autoclaver les pièces de verre et d' oxyde d'éthylène et stériliser les pièces en matière plastique pour assurer la stérilité. Différentes sous-unités du système peuvent être assemblés dans une hotte à flux laminaire, avant d'être monté sur la béquille de support. Circulant bain d'eau et le chemin d'écoulement d'eau chauffée a été omis pour la clarté.
3. Remplir le système assemblé avec 120 ml de milieu de culture de tissu (voir l'étape 5.15).
4. Placez la matrice de coeur cathétérisé de l'étape 2.14 dans un 60 mm culAntenne ture sous grossissement et connecter une seringue de 1 ml avec 22 G x 1 aiguille chargée de suspension cellulaire de l'étape 5.20 au cathéter. Assurez-vous que cette assemblée est libre de bulles d'air pour éviter embolisation cœur.
5. perfuser doucement les 100 pi de suspension cellulaire dans la matrice cardiaque par les artères coronaires. Une fois terminé, détacher la combinaison seringue / aiguille.
   NOTE: Une perfusion lente d'env. 20 ul par minute est nécessaire pour empêcher les cellules de couler des veines, qui transite sur le cœur.
6. Avec un bout émoussé 22g solidaire du raccord Luer sur la face inférieure du couvercle du bocal de coeur bioréacteur, pousser le cathéter sur la tubulure.
7. Démarrer la pompe péristaltique et observer que les flux se déroule comme décrit dans la figure 2. Produit de débit du réservoir par la pompe à travers le piège à bulles au cathéter placé dans l'aorte à l' étape 2.5 (chemin rouge sur la figure. 2). Observer l'écoulement de la circulation cardiaque en dehors de la veines et au goutte à goutte de l'apex, recirculation vers le réservoir de médias.
   REMARQUE: Le débit de perfusion dépend de différents facteurs tels que la résistance vasculaire de la construction et de la taille du cœur, mais un taux de 50 à 100 ul / min est un bon point de départ. Aux points de temps intermédiaires, les évaluations fonctionnelles peuvent être exécutées. L'échelle de la taille du cœur recellularized néonatale limite les évaluations, qui peuvent être réalisées , mais nous avons déterminé que les systèmes basés optiquement peuvent être utilisés pour quantifier en battant le comportement comme ils ont été utilisés dans des coeurs de rats adultes. ⁴ La construction peut être perfusé pour étendu périodes de temps (jusqu'à 23 h).

Résultats

décellularisation
En moyenne, le temps de décellularisation d'un cœur de P3 en utilisant ce protocole est d'environ 14 heures. étant donné un poids cardiaque moyenne de 23 mg pour le nouveau-né de P3.

Acellularity
Figure 3a montre un coeur néonatal P3 intact (toute la montagne). Figure 3b montre le même cœur suivant décellularisation. Les

Discussion

La dépendance de cette technique sur des perfusions répétées du cœur fait éviter d'une embolie, une composante essentielle d'un résultat positif. À partir de la première cathétérisation du cœur dans les étapes 2,2-2,6, aux changements de solution entre les étapes 2.8-2.14, il y a des manipulations qui peuvent permettre l'introduction de bulles d'air qui compromettent l'écoulement du liquide de perfusion dans le myocarde. En raison de la petite taille du cœur du nouveau-né, même de m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.