Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

Summary

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

אי ספיקת לב היא נפוצה וקטלנית. זוהי מחלה פרוגרסיבית כי תוצאות התכווצות ירד של הלב, אשר משבש את זרימת דם לאיברים ועוזב את הדרישות המטבוליות של הגוף מסופק. ההערכה היא כי 5.7 מיליון אמריקנים סובלים מאי ספיקת לב וזה הגורם העיקרי של אשפוז בארצות הברית ^9. העלות הקולקטיבית של טיפול בחולים באי ספיקת לב בארצות הברית עולה על 300 $ מיליארדים דולרים בשנת ^9-10. הטיפול סופי רק עבור אי ספיקת לב סופנית הוא השתלת לב orthotopic. בכל שנה, ההערכה היא כי יותר מ -100,000 לבבות תורמים נדרשים נהלים השתלה לב בארצות הברית ^1-2. לאור המספרים של תורמים המוגבלים, רק כ -2,400 השתלות מבוצעות מדי שנה בארה"ב ^2. ברור, מחסור האיבר הזה צריך להיות מטופל כמו אסטרטגיות אחרות נדרשות לייצר איברים נוספים transplantation, באופן אידיאלי, איברים אלה יהיו עצמיים כדי למנוע סיבוכים הקשורים דחיית דיכוי חיסוני בחיים.

Cardiomyocytes המבוגר יונק להפגין יכולת התחדשות מוגבלת על פגיעה, אך הראיות אחרונות עולה כי לבבות בילוד יונקים לשמור על יכולת התחדשות מדהימה בעקבות פציעת ^5-8. באופן ספציפי, לאחר כריתה כירורגית חלקית, חלון משוב התגלה בין יום לידה ואחרי הלידה 7. זה תקופת משובי מאופיין בחוסר צלקת פיברוטית, היווצרות נאווסקולריזציה, שחרור גורמי angiogenic מן epicardium, ו cardiomyocyte התפשטות ^{5-8 , 11.} חלון משוב זה זמן מספק את הפוטנציאל לשימוש בלב בילוד כמקור רומן של חומר לפיתוח לב bioartificial.

מטריקס ידוע לספק רמזים חשובים לקדם cardiomyocytהתפשטות וצמיחה דואר. הבדלים ברורים בזמינויות מולקולות מטריצות הילודים מבוגרים ¹² ויכולנו לקדם התחדשות נחקרו ^13. מטריצות מבוגרות decellularized שמשו מספר מחקרים לספק פיגום ECM עבור ואכלוס הסלולר והדור של לב bioartificial. בעוד שמחקרים אלה, ותגליות חדשות בטכנולוגיות תאי גזע, מתקדמים במהירות, מספר משוכות טרם נפגשו. לדוגמא, מגבלות בשימור מבנה יליד המטריצה, אינטגרציה הסלולר בקיר מטריקס, ואת היכולת לתמוך התפשטות וצמיחה כל להגביל את ההצלחה של גישה זו. בעוד תכונות התחדשות מעולות כבר ייחסו ללב בילוד, על ההיבטים המעשיים של שימוש ברקמות כגון מוגבל החיפושים שלה.

בהתבסס על יכולת ההתחדשות הפגינה הלב בילוד, פתחנו מטריצות רומן על ידי פיתוחטכניקה של decellularization ללב עכבר P3. לב P3 נבחר ללימודים אלה כפי שהוא בתוך החלון של התחדשות לב כמו בעבר נקבע ⁶ אבל הלב הוא גדול מספיק כדי קציר, decellularize ו recellularize. מטרת המחקר הנוכחי היא להוכיח את ההיתכנות של יצירת מטריצת מלב עכבר בילוד. המחקרים שלנו לספק ראיות על היתכנותו של decellularizing דקה, לב בילוד תוך שמירה על שלמות מבני חלבוניים של ECM. כמו כן, אנו מדגימים את היכולת recellularize ECM לב זה עם cardiomyocytes mCherry לבטא ואנחנו בחנו cardiomyocytes אלה עבור ביטוי של סמנים לבביים שונים הבאים recellularization. טכנולוגיה זו תאפשר בדיקה של עליונות של מטריצה ​​בילוד לפיתוח לב bioartificial.

Protocol

כל הניסויים העכבר בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי-חיים בארה"ב אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מינסוטה.

1. שיטת בידוד לב עכבר

1. להרדים עכבר בילוד ידי עריפת ראש עם להב ליחד.
2. ספוגית החזה עם 70% אתנול.
3. לנתח העור מהחזה על ידי חיתוך זה מקיר החזה במספריים רגילים תוך משייכת העור רוחבית עם זוג # 5 מלקחיים.
4. לחורר את הבטן רק נחה עצם החזה עם המספריים על ידי חיתוך דרך דופן הבטן. לתפוס את תהליך xiphoid עם מלקחיים # 5, לחזור בו עצם החזה rostrally מהגוף תוך צמצום אף כי צלעות משני צדי החזה עם מספריים. כלוב הצלעות משתקף superiorly עם המלקחיים כדי לחשוף את הלב.
5. בבוטות לנתח את שתי אונות הראשיות של התימוס ידי משייכת רוחבית עם # 5 מלקחיים, חשיפההקשת של אבי העורקים, כמו גם הוורידים caval ו ריאתי.
6. Transect העורקים הגדולים מן קשת אבי העורקים, ואת אבי העורקים עצמה, עם מספריים באביב 10 ס"מ. שמור האאורטה בין הבסיס של הלב העורק brachiocephalic. אחוז הקצוות של כלי נקטע עם # 5 מלקחיים כדי לשקף את הלב קדימה, הפרידה בינו לבין קנה הנשימה והוושט.
7. Transect בכלי הדם הריאתי וורידים מרכזיים אחרים, על ידי חיתוך בין הריאות והלב משני צידי הלב עם מספריים באביב 10 ס"מ. הוורידים פתוחים לספק ניקוז.
8. הסר את הלב מן mediastinum עם # 5 מלקחיים, לתפוס את הקצוות הכרותים של הכלי המרכזי. מניחים את הלב בצלחת תרבות 60 מ"מ המכיל בופר פוספט סטרילית (PBS) עבור צנתור.

2. שיטה Decellularization ידי Langendorff זלוף

1. הכן את הרכבת קטטר מראש. צייר סעיף 4 ס"משל PE 50 צינורות בלהבת אלכוהול קטנה כדי ליצור צנתר קטן, רזה. חתוך את הקצוות עם סכין כדי לענות על המידות (מקורב. 300 מיקרומטר OD קוטר חיצוני עם מקורבות של OD כ. 500 מיקרומטר) שמוצגות באיור 1. זה יספק שני צנתרים סימטריים מכל צד של המשיכה.
2. כוון את הקצוות של הצינור לתוך הלהבה בקצרה, כדי להמס מקורב על הפתיחה בסוף הדק.
3. מלאו את המזרק 12 מ"ל עם PBS ולהרכיב את הקטטר על ידי הצבת שסתום 3 כיווני על המזרק. הוספת 22 G x 1 מחט הברזלים ולהוביל את המחט דרך מחץ. החלק את הקטטר צינורות PE נמשך על המחט (איור. 1).
4. להשקות את החלקים שהותקנו עם PBS, והבטיח כי כל בועות האוויר הוסרו.
5. הכנס את קטטר, הכינו כפי שתואר לעיל, לתוך אבי העורקים של הלב מבודד, לא הארכת בעבר שסתום אבי העורקים ולקשור עם עניבה אחת 7-0 תפר. לנוח המקורב של tהוא קטטר proximally נגד עניבה, מה שהופך חותם חזק ומניעת בלב מלבוא את הקטטר.
6. שים לב הצנתור בהגדלה, בעוד בעדינות מרוססת בלב באמצעות המזרק המכיל PBS. ודא שאין נזילות במערכת ואת רקמת מחוויר הומוגנית כמו מוסר דם סמוי.
7. מניח את מחץ לתוך הצוואר של מתאם הכניסה ולאטום אותו על ידי קיפול הצדדים על פני הזכוכית.
8. חברו את המיכל מלא 60 מ"ל של סולפט dodecyl נתרן 1% (SDS) במים מזוקקים (DH ₂ O) באמצעות קו של אורך מספיק כדי לייצר טור שיוצר 20 מ"מ כספית בלחץ כפי שמוצג באיור. 1. חשב את הלחץ מן גובה העמודה נוזלי מבוסס על מערכת יחסים של 1 מ"מ כספית שווה 1.3595 ס"מ H ₂ O.
   זהירות: SDS היא אבקה צמרית מאוד עם תכונות מגרה. לתקשר יש להימנע. טפול האבקה באמצעות ביגוד מגן מתאים.
9. Perfuse הלב עם 1 SDS% במשך 14 שעות. הלב יהיה שקוף במראה ללא רקמה נותרת נצפית.
10. לרוקן את המערכת עד ברזלים של הפתרון SDS הנותרים ולהחליפו 10 מ"ל DH ₂ O. Perfuse הלב עם 10 מ"ל 1% Triton X-100 (מדולל במים מזוקקים), ואחריו 10 מ"ל DH ₂ O, ואחריו 60 מ"ל PBS המכיל סטרפטומיצין פניצילין 1x (עט סטרפטוקוקוס).
11. אחסן את הלב ב- PBS עם 1x עט סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס. אם יישום פוסט decellularization המיועד דורש זלוף אז את הקטטר באב העורקים צריך להישמר, אחרת לחתוך את הקשר תפר ולהסיר את הקטטר.

קביעת DNA 3.

1. הכן תקציר של הלב ECM או שליטה decellularized באמצעות 200 מיקרוגרם / מ"ל proteinase K ב 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl _2, 0.45% Tween 20 ב 10 מ"מ טריס (pH 8.3).
2. דגירת הרקמה ב 55 ° C עם תסיסה עד להמסת הרקמה,בדרך כלל 4-5 שעות.
3. לכמת את התוכן DNA של homogenate עם DNA מחייב assay ^4,11.

קיבוע 4. חתך של רקמות

1. תקן decellularized, recellularized או P3 מלא לבבות paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
2. שטפו את הרקמה PBS 3x.
3. הנח את הרקמה בתמיסה של סוכרוז 7.5% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C. עד שהיא שוקעת.
4. שינוי הפתרון סוכרוז 15% חיץ פוספט 0.1 M ב 4 ° C, שוב, עד שהיא שוקעת.
5. מומלץ לחמם את רקמות על 37 מעלות צלזיוס, להחליף מחצית מהמחזור עם פתרון ג'לטין ב סוכרוז 15% & חיץ פוספט 0.1 M לאזן בין לילה. ריכוזים של ג'לטין גדלו בשלבי דרך 1%, 2.5%, 5% ולבסוף 7.5% פעמים.
6. מניחים את דגימות cryomolds באמצעות ג'לטין 7.5% טרי. כדי לשחזר את הצורה של דגימות decellularized, ג'לטין נוזלי ניתן perfused לתאי כמו tהוא לבבות ומעוצבים. להקפיא ידי הצפת cryomolds על חנקן נוזלי. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
7. חותכים (10 מיקרומטר עבה) קטעים עם cryostat. תביא את השקופית הקרובה לפני שטח הסעיף ולבחון את הסעיף ומתרחק מן הסכין על פני השטח בשל התשלום בשקופיות המטופלים אלקטרוסטטי. לייבש את השקופיות לילה ולאחסן ב -80 ° C לצורך ניתוח עתידי.
8. הסר את השקופיות מהמקפיא, לאזן לטמפרטורת החדר ואז ומניחים בצנצנת Coplin המכיל PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את הג'לטין.
9. הכתם בסעיפים לחתוך משלב 4.7 עם Hematoxylin ו Eosin. מקום שקופית בתוך צנצנת Coplin. לחשוף את השקופיות hydrated בשלב 4.8 כדי Hematoxylin במשך 45 שניות, מי ברז עבור 1.5 דקות, חיץ במשך 3 דקות, מי ברז דקות 1, bluing סוכן עבור 1.5 דקות, 80% אתנול דקות 1, אלכוהוליים Eosin Y עבור 8 שניות, 80% אתנול דקות 1, 100% אתנול עבור 1 2x דקות, ניקוי סוכן (תחליף קסילן) עבור 1 3x דקות, coverslip עם שרףהרכבה בינונית מבוסס. בדוק את השקופיות מיקרוסקופיות.
10. כדי לאשר את השמירה של תגובתיות חלבון ECM של ECM הלב, כתם במשך חלבונים מבניים ECM כגון קולגן IV על ידי הצבת את השקופיות hydrated בתא humidified ולטפל עם 10% בסרום חמור נורמלי (NDS) ב בופר פוספט עם 0.1% Triton -X100 (PBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT). השתמש נפח מספיק כדי לכסות את סעיפי רקמות.
11. החלף את הפתרון עם הנוגדן הראשוני מועדף דילול לקבוע באופן אמפירי ב 5% NDS / PBST. לדוגמא, נוגדן קולגן IV היה מדולל ב 1: 150. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
12. שטפו את השקופיות עם PBST 3x ולהחיל נוגדנים משני הבחירה מצומדות עם פלורסנט לצבוע. לדלל את הנוגדן בסכום לקבוע באופן אמפירי. דגירה במשך שעה 1 ב RT. לשטוף עם PBS 3x.
13. כתם השקופיות עם צבע DNA מחייב כגון DAPI לאמת בהיעדר גרעיני תאים באמצעות mounti המכיל DAPIng בינוני כאשר הכיסוי מחליק את השקופיות.
14. בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 50 עד 400X.

5. P1 ילודים Murine חדרית cardiomyocytes עבור Recellularization

1. ריסוס כל גור עם 70% אתנול ו לערוף עם להב לייחד.
2. חזק כל גור בין האגודל והאצבע תוך בית החזה מחולק על קו האמצע עם מספרי סטרילי קטנים כדי לחשוף את חלל בית החזה. החל הלחץ על מנת לאפשר את הלב כדי לבלוט בחופשיות מהחזה בזמן שהוא נחתך חינם של כלי מרכזי הפרוזדורים לעזוב את רקמת חדרית בלבד.
3. מניחים כל הלב ישירות לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל סידן קר כקרח, תמיסת מלח שנאגרו של האנק חינם ביקרבונט עם 20 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (CBFHH) עד כל הלבבות נאספים.
4. לשאוב CBFHH ולהוסיף 10-15 מ"ל של CBFHH טריים (קרים כקרח) אל הצינור. שטפו את הרקמה על ידי מתערבל את הרקמה tהוא הצינור מספר פעמים.
5. למזוג את הפתרון המכיל את הלבבות לתוך צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ.
6. לנתח כל רקמה סמויה פרוזדורים מלבם בהגדלה על קרח ידי זמירה אותו הרחק הלבבות עם מספרי האביב. לרכך את החדרים לחתיכות קטנות בגודל homogenously. הסר את כל רקמה שאינה חדרית מופרדת מהצלחת עם מלקחיים 5 #.
7. Pipet כמה שיותר הפתרון CBFHH כפי שנדרש להעביר את שברי רקמה לתוך בקבוקון סטרילית קטן המכיל בר ומערבבים מיקרו סטרילי.
8. לאפשר לרקמות משקעות לתחתית של הבקבוקון ולהסיר פתרון CBFHH.
9. מאפרים 50 מ"ל של פתרון אנזים 1.75 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase השנייה CBFHH. Pipet 5 מ"ל של תמיסת אנזים זה ולהוסיף אותו צינור המכיל רקמות חדרית טחון ומניחים על בוחש מגנטי. מערבבים בקצב קבוע (340 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות.
   הערה: פעולת הערבוב צריכה להיות עדינה ובכל זאת לאפשרהשעייתו של תרחיף.
10. הסר את הבקבוקון מהצלחת והמערבבים ולאפשר את התערובת הדלילה עד המשקעים במשך 3 דקות. Pipet וזורק supernatant לעכל ראשוני, כפי שהוא בעיקר מכיל תאי דם ופסולת רקמות.
11. Pipet aliquot 5 מיליליטר השנייה של פתרון האנזים ולהוסיף אותו החדר לעכל. מערבבים במשך 8 דקות ולאפשר לו משקעים במשך 3 דקות אחר. לפני תחילת מעכל, להכין שני צינורות 50 מ"ל (המסומנת 1 ו -2) שכל אחת מהן מכילה 12 מ"ל קר כקרח עוברי בסרום שור (FBS). מניחים מסננת תא 40 מיקרומטר גבי צינור אחד. Pipet supernatant זו דרך המסנן על צינור 1.
12. חזור על תהליך העיכול פעמים 8 נוספים, לסירוגין המיקום של supernatant לעכל בין שני צינורות המכילים FBS. פיצול supernatant האחרון שווה בשווה בין צינורות 1 ו -2 כדי להבטיח כמויות שווות בצינור אחד.
    הערה: כל צינור איסוף יכיל חברה 32.5 מיליליטר נפח כולל של השעית תא.
13. בצנטריפוגה צינורות המכיליםing את XG supernatant 150 עבור 6 דקות ב 4 ° C.
14. בעוד איסוף aliquots העיכול, להכין חמש צלחות תרבות 100 מ"מ רקמת עם 6 מ"ל של התקשורת (מדיה של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS, 1x עט סטרפטוקוקוס, 1x L- גלוטמין) לכל צלחת. דגירה aliquots אלה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 30 דקות כדי לאזן את התקשורת.
15. לשאוב את התערובת אנזים CBFHH ו resuspend התאים לתוך 30 מ"ל של התקשורת בתרבות מוכן לעיל, שילוב תאים משני צינורות איסוף.
16. חזור 6 מ"ל של תרחיף תאים לכל אחד צלחות 100 מ"מ ו דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
17. בסוף הדגירה, העברת תאים שאינם חסידים עד 5 מנות חדשות מחדש דגירה של 45 דק '(השבר פיברובלסטים יהיה החל לדבוק את הכלים ניתן לגדל בנפרד אם רוצה).
18. בסוף הסיבוב השני של ציפוי מראש, לאסוף את המדיה ותאי לא חסיד מן המנות ספין לתקשורת ב 150XG במשך 6 דקות.
19. צייר את תקשורת עודפת להביא את התאים לריכוז הרצוי המשוער, (4.0 x 10 ⁵ תאים לכל לבנות ב 100 μl של perfusate). הסרת aliquot לבדיקת ספירה או כדאיות ^14.

6. Bioreactor Recellularization של מטריקס הלב P3

1. Pretreat מטריצת הלב המבודד עם תקשורת והתרבות (ראה שלב 5.15) לילה לפני הוספת התאים.
2. הרכיבו את האלמנטים של מערכת Langendorff כפי שמוצג באיור. 2. החיטוי חלק זכוכית אתילן אוקסיד לעקר את חלקי הפלסטיק כדי להבטיח סטריליות. יחידות משנה שונות של המערכת ניתן להרכיב במנדף זרימה למינרית לפני רכוב על דוכן תמיכה. באמבט מים במחזור ואת נתיב זרימת מים מחומם הושמט לבהירות.
3. מלא את המערכת המורכבת עם 120 מיליליטר של תקשורת בתרבות רקמות (ראה שלב 5.15).
4. מניח את מטריצת לב צינתור משלב 2.14 של מועצה עירונית 60 מ"מימצלחת ture בהגדלה ולהתחבר מזרק 1 מ"ל עם 22 G x 1 מחט עמוסה ההשעיה תא משלב 5.20 על קטטר. ודא כי הקהל הזה הוא ללא בועות אוויר כדי למנוע embolizing בלב.
5. בעדינות perfuse 100 μl של השעית תא לתוך מטריצת הלב דרך העורקים הכליליים. לכשיושלם, לנתק את שילוב מזרק / מחט.
   הערה: זלוף איטי של כ. 20 μl לדקה נדרש כדי למנוע את התאים מלצאת הוורידים, העוברים בלב.
6. עם בדל 22g בוטה מאובטח ההולם Luer על החלק התחתון של מכסה צנצנת לב bioreactor, לדחוף את הקטטר אל הבדל.
7. הפעל את משאבת peristaltic ולבחון כי תמורת הזרימה כמתואר באיור 2. תמורת זרימה מהמאגר באמצעות המשאבה דרך מלכודת הבועה הקטטר להציב האאורטה בשלב 2.5 (השביל אדום באיור. 2). שים את זרימת מחזור הדם של הלב מתוך הוורידs ו טפטוף מן הקודקוד, הסירקולציה המחודשת למאגר התקשורת.
   הערה: קצב זרימת זלוף תלוי בגורמים בודדים כגון התנגדות כלי הדם של המבנה, ואת גודל הלב, אבל בקצב של 50 עד 100 μl / min הוא נקודת התחלה טובה. בנקודות זמן ביניים, ניתן לבצע הערכות תפקודיות. סולם גודל הלב בילוד recellularized מגביל את ההערכות, כי ניתן לבצע אך שקבענו מערכות מבוססות אופטי יכולות לשמש כדי לכמת להכות התנהגות בדיוק כפי שהם שמשו לבבות עכברוש מבוגרים. ⁴ הבונה ניתן perfused מורחבת תקופות של זמן (עד 23 שעות).

תוצאות

decellularization
בממוצע, זמן decellularization של לב P3 באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 14 שעות. מקבלת משקל לב ממוצע של 23 מ"ג עבור ילוד P3.

Acellularity
איור 3 א מדגימים לב בילוד P3 במלואו ללא פגם (...

Discussion

התלות של טכניקה זו על perfusions החוזרת והנשנית של הלב הופכת את ההימנעות של תסחיף מרכיב קריטי של תוצאה מוצלחת. מתוך הצנתור הראשוני של לב שלבי 2.2-2.6, לשינויים של פתרון בין שלבי 2.8-2.14, יש מניפולציות שיכולים לאפשר כניסתה של בועות אוויר אשר פשר זרימת perfusate לתוך שריר הלב. בשל גודלו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.