إنشاء وزرع للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) ورقة في نموذج التئام السكري

Summary

هي عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (الخزفية) وتحصد من الدهون الفئران العادية بسهولة. أوراق الرابطة يمكن إنشاؤها باستخدام هندسة الخلايا--ورقة ويمكن زرعها في زوكر الجرذان الدهنية السكري العارضة كامل-سمك الجلد العيوب مع العظام مكشوفة ومغطاة ثم بيلايير جلد الاصطناعي.

Abstract

الجلد الاصطناعي حققت نتائج علاجية كبيرة في الممارسة السريرية. ومع ذلك، قد يطول علاجات البشرة الاصطناعية للجروح في مرضى السكري مع تدفق الدم إعاقة أو الجروح الكبيرة. ظهرت العلاجات المستندة إلى الخلية كتقنية جديدة لعلاج قرح السكري، وهندسة خلية ورقة تحسنت فعالية زرع الخلايا. وقد اقترح عدد من التقارير أن الدهنية المستمدة من الخلايا الجذعية (الخزفية)، نوع من خلايا mesenchymal stromal (MSC)، يحمل إمكانات العلاج بسبب هذه الوفرة النسبية في الأنسجة الدهنية، وإمكانية الوصول لمجموعة بالمقارنة مع MSCs من الأنسجة الأخرى. ولذلك، يبدو الخزفية مصدرا جيدا لخلايا الجذع للاستخدام العلاجي. في هذه الدراسة، إنشاء أوراق الرابطة من الدهون الدهنية البربخيه العادي لويس الفئران بنجاح باستخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة والمتوسطة الثقافة العادية التي تحتوي على حمض الأسكوربيك. أوراق الرابطة تم زرعها في الجرذان الدهنية السكري (زد دي إف) زوكر، نموذج الفئران من مرض السكري من النوع 2 والبدانة، أن المعرض تقلص التئام الجروح. تم إنشاؤه بجرح على سطح الجمجمة الخلفية وأوراق ASC تم زرعها في الجرح وجلد اصطناعي بلير كان يستخدم لتغطية الأوراق. زد دي إف الفئران التي تلقت أوراق الرابطة كان أفضل التئام الجروح من الفئران زد دي إف دون زرع أوراق ASC. وكان هذا النهج محدودة نظراً لأن الرابطة أوراق حساسة للظروف الجافة، التي تتطلب الحفاظ على بيئة الجرح رطبة. ولذلك، استخدم لتغطية الورقة ASC لمنع تجفيف الجلد الاصطناعي. زرع allogenic أوراق ASC في تركيبة مع الجلد الاصطناعي يمكن أن ينطبق أيضا على غيرها قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت مع أمراض الشرايين الطرفية وأمراض الكولاجين، وقد تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. وهكذا، هذا العلاج قد يكون الخطوة الأولى نحو تحسين الخيارات العلاجية لمرضى السكري الجرح الشفاء.

Introduction

سكان مرضى السكري يتزايد في جميع أنحاء العالم، ووصلت إلى 400 مليون بحلول عام 2015¹؛ ما يقدر 15-25 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض السكري هم في خطر من تطور قرحة السكري السفلي أقصى². قرحة السكري السفلي أقصى مستعصية على الحل، وقد تتطلب فترة علاجية طويلة مع إعادة التأهيل التدريب بعد الشفاء الكامل. فترة علاج طويلة وكثيراً ما ينتج عن انخفاض كبير في نوعية حياة المريض. وبالتالي، يجب تطوير علاجات جديدة أن تقليل أو منع تفاقم لعلاج الجروح السكري. نحن الأمثل لتقييم التئام الجرح السكري، قرحة السكري التئام نموذجا في الفئران، الذي يحاكي الظروف السريرية العملية، وتقييم ما إذا كان زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) الأوراق باستخدام هندسة الخلايا-ورقة تسارع التئام الجروح.

يحمل الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بإمكانيات ممتازة لتسريع التئام الجروح بسبب قدرتها على التجديد الذاتي، وآثارها إيمونومودولاتوري، وقدرتهم على التفريق في خلية مختلفة الأنساب³. الخزفية نوع من لجنة السلامة البحرية المستمدة من الأنسجة الدهنية، وأنهم يحمل العديد من المزايا المستمدة من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك تلك الأوعية المحتملة و paracrine النشاط^4،5MSCs. الأنسجة الدهنية وفيرة نسبيا في الجسم البشري، وإمكانية الوصول إليها ويتيح تجميع باستخدام إجراءات كسبها. ولذلك، استخدمت الخزفية تجريبيا لالتئام تطبيقات^6،7.

وقد أظهرت التقارير السابقة أن الحقن المباشر لخلية واحدة ماجستير المعلقات في المناطق المحيطة بالجروح ويمكن التعجيل بالجرح الشفاء^8،9. ومع ذلك، وعلى الرغم من التقارير للإسراع بالتئام الجروح في نماذج قرحة السكري بعد حقن تعليق خلية واحدة، الوقت البقاء على قيد الحياة من زرع الخلايا في موقع الجرح ليس واضحا.

في هذه الدراسة، قمنا بتطبيق الهندسة خلية ورقة استخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. هذه الأطباق قد تستجيب لدرجة الحرارة البوليمر N-إيسوبروبيلاكريلاميدي تساهمي ملزمة على السطح عن¹⁰. طبقة البوليمر المطعمة يسمح لالتصاق الخلايا درجة الحرارة التي تسيطر على أو مفرزة من السطح الطبق الثقافة. يصبح سطح الطبق مسعور في 37 درجة مئوية، والسماح للخلايا بالانضمام وتتكاثر، حين فصل الخلايا تلقائياً من السطح عندما يصبح ماء في درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. يمكن حصادها الخلايا المستزرعة كورقة خلايا متجاورة مع تقاطعات خلية إلى خلية سليمة ومصفوفات خارج الخلية (ECMs) ببساطة عن طريق تخفيض درجة الحرارة؛ وهكذا، لا proteolytic الإنزيمات التي تلحق الضرر إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل التربسين، مطلوب¹¹. ولذلك، يمكن الحفاظ على اتصالات خلية إلى الهندسة خلية ورقة وتحسين فعالية زرع الخلايا.

وباﻹضافة إلى ذلك، زرع خلية ورقة يزيد معدلات بقاء الخلية عند مقارنتها ب حقن الخلية¹². واختيرت زوكر السكري الدهنية في الفئران (زد دي إف) في هذا البروتوكول، كنموذج نوع 2 مرض السكري والسمنة مع تأخر التئام الجروح. الفئران زد دي إف تلقائياً وضع السمنة في 4 أسابيع تقريبا. ثم يطورون مرض السكري من النوع 2 مع السمنة بين 8 و 12 أسبوعا من العمر، وعند هذه النقطة يحمل فرط سكر الدم المرتبطة بالانسولين المقاومة ودسليبيدميا hypertriglyceridemia¹³. كما لوحظت الجرح تأخر الشفاء، تدفق الدم انخفاض في الأوعية الدموية المحيطية، وحدوث السكري^14،،من¹⁵¹⁶. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الفئران زد دي إف نموذجا مناسباً لدراسة الشفاء من القرحة الجلدية المستعصية، مثل قرح مرضى السكري.

الاختلافات بين البشر والقوارض في التئام الآليات المرتبطة بالاختلافات التشريحية في الجلد. الجرح الشفاء في الفئران العادية يستند إلى انكماش الجرح، حين التئام الجروح في البشر يستند تشكيل epithelialization إعادة وتحبيب الأنسجة. بشكل عام، الجرح التجبير المستخدمة في نماذج القوارض يساعد على التقليل من انكماش الجرح ويسمح بتشكيل التدريجي للأنسجة تحبيب¹⁷، على الرغم من أن يتم إغلاق الجروح في الفئران نونديابيتيك تقريبا تماما بتقلص. ولكن الجرح السكري الانكماش في زد دي إف الفئران البصر، ويحدث الجرح الشفاء في المقام الأول من خلال إعادة ابيثيلياليزيشن وتشكيل النسيج تحبيب؛ وهكذا، أن هذه العملية أشبه بالجرح البشرية شفاء¹⁴.

السكري الجروح مع العظام المكشوفة بعد debridement غالباً ما تواجهها سريرياً. تبحث الدراسات السابقة الجراح الجلد كامل-سمك قطرها 12 مم على ظهورهم athymic الفئران عارية^،من¹⁸إلى¹⁹ والجراح الجلد كامل-سمك قطرها 10 ملم على ظهورهم من الفئران العادية²⁰. إلى وضع نموذج السريري لجروح السكري الحاد، أكبر العيوب كامل-سمك الجلد (15 × 10 مم²) مع كشف العظام ودون السمحاق تم إنشاؤها، كما هو موضح سابقا²¹، في الفئران مع داء السكري من النوع 2 والبدانة.

الفئران أوراق ASC (مراجعة الحسابات) من الخزفية العادية لويس الفئران تم إنشاؤها من خلال زرع allogenic صحائف ASC. في الممارسة السريرية، زرع ذاتي غير مجد لأنه غالباً ما يحمل مرضى السكري مع القرحة مضاعفات السكري الحادة، مثل مستويات الجلوكوز في الدم غير المنضبط ومؤشرات كتلة الجسم عالية، وهذه مضاعفات قضية التئام الاضطرابات التي تزيد من صعوبة الحصول على الأنسجة الدهنية من هؤلاء المرضى. وعلاوة على ذلك، الخزفية من الحيوانات مع معرض داء السكري تغيير خصائص وإعاقة وظيفة²². ولذلك، يصف البروتوكول المعروضة هنا زرع allogenic أوراق مراجعة الحسابات من الفئران العادية وتطبيق الجلد الاصطناعي للفئران السكري.

الجلد الاصطناعي بيلايير المستخدمة في هذا البروتوكول يمنع انكماش عفوية من الجروح ويعزز التوليف النسيج الضام مصفوفة جديدة ويشبه الأدمة صحيح²³. في هذا البروتوكول، ووضعها على ورقة مراجعة الحسابات الجلد الاصطناعي والثابتة مع خيوط النايلون لمنع تقلص الجرح أو توسيع الناتجة عن الفئران فضفاضة الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، الجلد الاصطناعي يوفر إطارا ثلاثي الأبعاد للأوراق ASC ويحافظ على بيئة رطبة لزرع أوراق ASC والجروح، والجروح ويحمي من العدوى والقوى الخارجية. وأخيراً، يوضع خلع ملابس غير لاصقة فوق الجرح حمايته من التأثيرات الخارجية، والحفاظ على بيئة رطبة جرح، وامتصاص الإفرازات.

ورقة مراجعة الحسابات رقيقة ومرنة، وتشوه ويمكن التقيد بنقل المواقع المستفيدة، مثل ضرب قلب²⁴. هندسة خلية ورقة قد استخدمت لإعادة بناء الأنسجة المختلفة، ويمكن أن تولد الآثار العلاجية^25،26. أوراق الرابطة التي يحمل إمكانات العلاجية السريرية قد تسريع الشفاء من العديد من أنواع الجروح. وعلاوة على ذلك، زرع متمكنة من أوراق ASC، جنبا إلى جنب مع استخدام الجلد الاصطناعي، يمكن تطبيقها لمعالجة قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت في أمراض الشرايين المحيطية أو أمراض الكولاجين، أو أنها يمكن أن تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. هذا النهج يزيد من الكفاءة من زرع الخزفية. نموذج الفئران زد دي إف التئام ينتج شرط جرح شديدة التي تمثل عملية التئام الجرح البشرية ويحاكي الظروف السريرية في الحيوانات تجريبية الصغيرة الحجم.

Protocol

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women's Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.

1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes

1. Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 °C until use.
2. Use adult male ZDF rats as a type 2 diabetic obesity model. Use the fat pad of male Lewis rats to isolate adipose tissue to prepare the cell sheets.

2. Isolation and Culture of rASCs

1. Obtain adipose tissue from Lewis rats (8 - 33 weeks old, male) under general anesthesia using isoflurane.
   1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and a 5-0 nylon suture. Sterilize the surgical instruments and supplies.
   2. Prepare a 100-mm Petri dish with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) to temporarily preserve the obtained adipose tissue. Weigh the Petri dish with PBS using a balance before starting surgery to measure the collected adipose tissue. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
   3. Anesthetize the rats by using isoflurane at 3 - 4% via a rodent mechanical ventilator and maintain the rats at 2 - 3% isoflurane during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat.
   4. While wearing sterile gloves, position the rat in a supine position on a sterile drape. Shave the operative area with an electric razor and clean the abdominal section of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
   5. Create an approximately 5 cm-long skin incision with a scalpel in the lateral lower abdomen of the rat. Expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis. Gently pull the epididymal adipose tissue out.
      NOTE: The adipose tissue can be obtained on either side of the rat's abdomen.
   6. Excise only the epididymal adipose tissue, avoiding damage to the epididymis, testis, and epididymal blood vessels (Figure S1). Soak the excised adipose tissue in the PBS in the Petri dish to prevent dryness and weigh the tissue.
   7. Close the abdominal muscle with 5-0 VICRYL and the skin with a 5-0 nylon suture. Then, return each rat that has undergone surgery to a separate cage (one rat per cage).
      NOTE: Monitor the rats until they fully recover.
2. Isolate rASCs from 2 - 3 g of adipose tissue (excised from a Lewis rat and processed according to a previously-reported method)²⁷. Briefly, enzymatically digest the excised adipose tissue with 0.1% type A collagenase at 37 °C for 1 h to obtain the stromal-vascular fraction (SVF; Figure S2).
   1. Prepare several 100-µm cell strainers, several 50-mL tubes, several 15 mL tubes, and two scalpels on a biological clean bench. Turn on a centrifuge and warm up a water bath to 37 °C. In addition, prepare approximately 50 mL of sterile PBS in a 50 mL tube with 0.1% (final concentration) of type A collagenase.
   2. Mince the adipose tissue into small pieces using two scalpels.
   3. Move all minced adipose tissue to a 50-mL tube and add PBS to bring the total volume to 15 mL.
   4. Rest the 50-mL tube upright for 5 min. Discard the upper layer and collect the lower layer except for the debris.
   5. Add 0.1% of type A collagenase solution to the 50-mL tube with PBS containing the upper layer in order to enzymatically digest the adipose tissue.
      NOTE: Warm approximately 20 mL of PBS per 2 - 3 g of adipose tissue in a 37 °C water bath.
   6. Tilt and shake the 50 mL tube gently at 120 - 130 rpm for 1 h in a 37 °C water bath.
   7. Rest the 50 mL tube upright for 5 min after shaking.
   8. Filter the solution using a 100 µm cell strainer and pour the solution into a new 50 mL tube. Dispense the filtered solution into two 15 mL tubes.
   9. Centrifuge the solution in the 15 mL tubes for 5 min at 700 x g. Carefully remove the upper layer of supernatant and leave 5 mL of the lower layer of the solution. Do not aspirate the pellet.
   10. Add approximately 5 mL of complete culture medium to each 15 mL tube, up to 10 mL per 15 mL tube, and carefully re-suspend the pellet.
   11. Repeat steps 2.2.8 - 2.2.9. Then, obtain the SVF.
3. Prepare two 60 cm² culture dishes. Collect the SVF after two centrifugations at 700 × g for 5 min. Suspend the SVF and plate 10 mL of SVF solution on each 60-cm² culture dish.
4. Culture the dishes for 24 h at 37 °C in a 5% CO₂ incubator.
5. Prepare PBS and 0.25% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), storable for several months at 4 °C until use.
6. After initial plating (24 h), wash the cells with PBS 3 times to remove unattached cells and debris. Add fresh complete medium.
7. Passage the cells that are nearly sub-confluent on day 3. Add 1 mL of 0.25% trypsin-EDTA and incubate the cells at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 3 - 5 min.
   NOTE: Complete the trypsinization step within 10 min to prevent cell damage.
8. Observe the cells under a light microscope after trypsinization to confirm that all the cells have thoroughly detached from the dishes. Then, add 9 mL of complete culture medium to the dishes.
9. Count the number of cells using a hemocytometer.
10. Subculture the cells at a density of 1.7 x 10³ cells/cm² every 3 days until passage 3. Culture the subcultured cells at 37 °C in the humidified atmosphere of a 5% CO₂ incubator.

3. Creation of rASC Sheets

1. Prepare several 35-mm diameter temperature-responsive culture dishes. Pre-coat the dishes with FBS (or complete medium containing FBS) at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for more than 1 h.
   NOTE: A 35 mm diameter temperature-responsive culture dish is a commercially available product.
2. Prepare a thermo-plate and incubate at 37 °C for the following experimental procedures.
   NOTE: Perform every procedure using temperature-responsive culture dishes on a 37 °C thermo-plate to prevent the cells from spontaneously detaching from the dish.
   1. Warm the complete culture medium used in the procedures to 37 °C prior to experimentation.
   2. Seed passage 3 rASCs derived from Lewis rats onto a 35 mm diameter temperature-responsive culture dish at a density of 1.5 x 10⁵ cells/dish for 3 days using a 2 mL total volume of complete culture medium.
      NOTE: When rASCs are plated onto a new culture dish, the dish should be slowly rocked back and forth and left and right in an incubator to achieve uniform rASC seeding and a uniformly thick rASC sheet.
   3. Change 2 mL of the medium to 2 mL of complete culture medium containing 16.4 µg/mL L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (AA) on day 3 after seeding to the temperature-responsive culture dishes incubated on a 37 °C thermo-plate.
      NOTE: Dissolved AA can be stored at -30 °C for months.
   4. Culture the cells for an additional 4 - 5 days and replace the medium every 2 days with fresh medium containing AA.
   5. Confirm the proliferation and generation of ASCs under a light microscope to determine whether gaps occurred between the cells in a contiguous cell sheet.
3. Transfer the cell sheets from the incubator to the benchtop for 15 - 20 min to cool them to room temperature.; observe the cells spontaneously detach as a contiguous cell sheet. Harvest the rASC sheet from the dish surface with a pair of forceps.
   NOTE: Usually, rASC sheets can be handled with a pair of forceps. If necessary, a transfer membrane can be used to transfer a cell sheet from the culture dish to the wound site if the cell sheet is brittle and fragile.

4. Preparation of the Full-thickness Skin Defect Wound Model and Transplantation of rASC Sheets

1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauze, 5-0 nylon suture, a scalpel, a periosteal raspatory, a needle holder, operating scissors, and a pair of forceps. Sterilize the surgical instruments and supplies. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
2. Prepare PBS and maintain it at room temperature, along with some artificial skin and a non-adhesive dressing. Precut the artificial skin (15 x 10 mm) and non-adhesive dressing (20 × 15 mm). Soak the inner collagen sponge layer of the artificial skin in saline before using the artificial skin.
   NOTE: The artificial skin is made of two layers: an outer silicone sheet layer and an inner collagen sponge.
3. Use ZDF rats (16 - 18 weeks old, male, 500 - 600 g) as a wound-healing model for type 2 diabetes and obesity.
4. Anesthetize the ZDF rats by inhalation of 4% isoflurane using a rodent mechanical ventilator. Induce anesthesia by using isoflurane at 4 - 5% via a rodent mechanical ventilator and maintain it at 3 - 4% during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat via a toe pinch.
5. While wearing sterile gloves, position the rat in the prone position on a sterile drape. Clean the head of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol, shave the operative area with an electric razor, and clean the skin after shaving using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
6. Create a squared full-thickness skin defect (15 x 10 mm²) on the head of the anesthetized ZDF rats by removing the cutaneous tissue from the epidermis to the periosteum. Excise the skin and cutaneous tissue with a scalpel and remove the periosteum with a periosteal raspatory.
7. Move the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish from the incubator to a room-temperature environment immediately prior to transplantation.
8. Observe the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish spontaneously detach as a sheet from the dish surface after the formation of a wound. Harvest the rASC sheets after 7 days of culturing on temperature-responsive culture dishes. Remove the cultured medium and wash the rASC sheet with PBS three times. Soak the rASC sheet in PBS until transplantation to prevent desiccation.
9. Place the rASC sheet immediately over the skull defect using a pair of forceps. If the cell sheet is brittle and fragile, a membrane can be used as a scaffold for transferring the cell sheet from the culture dish to the wound site.
10. Cover the rASC sheet and defect with the artificial skin (15 x 10 mm²) and close the wound with approximately 10 stiches using the 5-0 nylon suture. To protect the wound, place a non-adhesive dressing (20 x 15 mm²) over the artificial skin, using 5-0 nylon sutures to keep the wound environment moist and to absorb exudates.
    NOTE: The non-adhesive dressings will be removed by the ZDF rats within a few days after application. Therefore, it is necessary to regularly monitor the rats after transplantation. Usually, the non-adhesive dressing is replaced every 2 days under general anesthesia.
11. Return each rat that has undergone surgery to a separate cage until they have fully recovered (one rat per cage). After an observation period, euthanize the rats using the approved method of isoflurane overdose.

النتائج

حاول هذا البروتوكول وضع علاج يستند إلى الخلية جديدة لجروح السكري مستعصية على الحل. بإيجاز (كما هو موضح في الشكل 1)، تم إنشاؤها من الفئران العادية باستخدام هندسة الخلايا-ورقة أوراق مراجعة الحسابات متمكنة وتم زرع ثم استخدام بلير للجلد الاصطناعي على عيب كامل-سمك جل?...

Discussion

أن الخطوات الأكثر أهمية لنجاح استزراع ورقة مراجعة الحسابات كما يلي: 1) يجب الحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 37 درجة مئوية خلال استزراع على أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. أثناء إنشاء ورقة مراجعة الحسابات، تم تنفيذ كل إجراء من الإجراءات على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية، وقد ارتفعت درجة ح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM glutamax	Invitrogen	32571-036	Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS)	Japan Bioserum Co Ltd.	S1650-500
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Collagenase A	Roche Diagnostics	10 103 578 001	Mannheim, Germany
60-cm2 Primaria tissue culture dish	BD Biosciences	353803	Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)	Life Technologies	1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Life Technologies	25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate	Wako	013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)	CellSeed	NUNC-174904	Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000)	Kitazato Science Co., Ltd.	1111
Rodent mechanical ventilator	Stoelting	#50206	Wood Dale, IL
4% isoflurane	Pfizer Japan	114-13340-3	Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®)	Smith & Nephew	PN-R40060	Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®)	Smith & Nephew	66800679	Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES	greiner bio-one	227 261
15mL Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL	Hu-Friedy	P14	Chicago, IL