Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs) kolayca izole ve normal sıçanlar FAT'tan hasat. ASC yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulabilir ve tam-kalınlık sergilenmesi diyabetik yağlı sıçanlar kusurları maruz kemik ile deri ve suni deri bilayer ile kaplı Zucker içine nakledilmektedir.

Özet

Yapay cilt klinik pratikte önemli tedavi edici sonuçlar elde etti. Ancak, Yapay cilt tedavileri engellemiştir kan akımı veya büyük yaralar ile diyabetik hastalarda yaralar için uzun süreli. Hücre tabanlı terapiler diyabetik ülser tedavisi için yeni bir teknik olarak yer aldı ve hücre sayfalık mühendislik hücre transplantasyonu etkinliğini geliştirdi. Raporlar bir dizi yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs), bir tür Mezenkimal stromal hücre (MSC), yağ dokusu ve onların erişilebilirlik için MSCs diğer dokulardan karşılaştırıldığında koleksiyonu için göreli onların bereket nedeniyle tedavi potansiyel sergi tavsiye ettiler. Bu nedenle, ASCs kök hücre terapötik kullanım için iyi bir kaynak gibi görünüyor. Bu çalışmada, ASC sayfaları normal Lewis sıçan epididimal yağ yağ sıcaklık duyarlı kültür yemekleri ve normal kültür askorbik asit içeren orta kullanarak başarıyla oluşturuldu. ASC sayfaları Zucker diyabetik yağ (ZDF) fareler nakledilen, yaranın normal tip 2 diyabet ve obezite, azalmış sorun oluşturan bir fare modeli. Bir yara arka kafatası yüzeyinde oluşturuldu, ASC sayfaları yara içine nakledilen ve bilayer Yapay deri çarşafları kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları alınan ZDF fareler daha iyi ZDF fareler ASC sayfaları nakli olmadan daha yaranın. ASC sayfası nemli yara çevre bakım gerektiren kuru şartlarda için duyarlı olduğundan bu yaklaşım sınırlıydı. Bu nedenle, Yapay cilt kurutma önlemek için ASC sayfası kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları Yapay deri ile birlikte allojenik nakli de diğer zorlu ülser veya burns, bu kollajen hastalığı, periferik arter hastalığı ile gözlenen gibi geçerli olabilir ve Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Böylece, bu tedavi diyabetik yara iyileşmesi için tedavi olanakları geliştirmeye yönelik ilk adım olabilir.

Giriş

Diyabetik hastalar nüfusu dünya çapında artan ve 20151400 milyon ulaştı; Diyabetli hastaların yaklaşık 15-%25 etkilenir alt ekstremite diyabetik ülser2ilerleme. Alt ekstremite diyabetik ülser zorlu ve uzun süreli tedavi nokta ile rehabilitasyon eğitim tam kurtarma sonra gereksinim duyabilir. Uzun tedavi süresi genellikle hastanın yaşam kalitesini önemli bir azalma olur. Böylece, yeni tedaviler tırmandığı önlemek veya azaltmak diyabetik yaralar tedavisi için geliştirilmelidir. Diyabetik yara iyileşmesi değerlendirmek için biz pratik klinik koşulları taklit eder, bir diyabetik ülser yara iyileşmesi modeli içinde rats, en iyi duruma getirilmiş ve değerlendirilmiş olup yağ kaynaklı kök hücre (ASC) yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanarak dikim hızlandırılmış yaranın normal iyileşmesi.

Mezenkimal stromal hücre (MSCs) kendi kendini yenileme kapasitesi, immunomodulatory etkileri ve yeteneklerini çeşitli hücre soy3içine ayırmak için nedeniyle yara iyileşmesi hızlandırılması için mükemmel bir potansiyel sergi. ASCs MSC Yağ dokusundan elde edilen bir türüdür ve onların anjiogenik potansiyel ve parakrin etkinlik4,5de dahil olmak üzere diğer dokulardan türetilmiş MSCs çeşitli avantajlar sergilemek. Yağ dokusu insan vücudunda nispeten bol ve minimal invaziv yordamları kullanarak koleksiyonu için erişilebilirlik sağlar. Bu nedenle, ASCs deneysel olarak yara iyileşmesi uygulamaları6,7için kullanılmaktadır.

Önceki raporları tek hücreli MSC süspansiyonlar direkt enjeksiyon yara çevresinde alanlara8,9şifa yara hızlandırabilir göstermiştir. Ancak, tek hücreli süspansiyonlar enjeksiyon takip diyabetik ülser modellerinde yara iyileşmesi ivme raporları rağmen yara yerinde transplante hücre sağkalım süresi net değildir.

Bu çalışmada, biz sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kullanarak hücre sayfalık mühendislik uygulanır. Bu yemekleri onların yüzey10kovalent bağlı sıcaklık duyarlı polimer N- isopropylacrylamide var. Aşılı polimer tabaka ısı kontrollü hücre adezyon veya kültür çanak yüzeyinden dekolmanı için izin verir. Çanak yüzeyi 32 ° c altındaki sıcaklıklarda Hidrofil hale geldiğinde hücreleri kendiliğinden yüzeyinden ayırmak ise uygun ve çoğalırlar, hücrelere izin 37 ° C'de hidrofobik hale gelir Kültürlü hücreler bitişik hücre sabıkası olduğu gibi hücre hücre kavşaklar ve ekstraselüler matrisler (ECMs) olarak sadece sıcaklık azaltarak hasat edilebilir; Böylece, ECM, tripsin gibi zarar proteolitik enzimler gerekli11değildir. Bu nedenle, hücre sayfalık mühendislik hücre hücre bağlantıları korumak ve hücre transplantasyonu etkinliğini artırmak.

Ayrıca, hücre-saç ekimi ne zaman hücre enjeksiyon12' ye göre hücre sağkalım oranları artar. Bu protokol için Zucker diyabetik yağlı (ZDF) fareler gecikmiş yara iyileşmesi ile tip 2 diyabet ve obezite model olarak seçildi. ZDF fareler kendiliğinden yaklaşık 4 hafta obezite geliştirmek. Daha sonra 8 ile 12 hafta-in yaş, bu noktada onlar insülin direnci, dislipidemi ve hipertriglisemik13ile ilişkili hiperglisemi sergi arasında obezite ile tip 2 diyabet geliştirmek. Gecikmiş yara periferik kan damarları ve diyabetik nefropati azaltılmış kan akımını şifa, ayrıca14,15,16görülmektedir. Ayrıca, ZDF fareler zorlu Kutanöz ülser, diyabetik ülser gibi şifa eğitim için uygun bir model olabilir.

Yara iyileşmesi mekanizmaları kemirgenler ve insanlar arasındaki farklılıkları deride anatomik farklılıklar ile ilişkilidir. İse insanlarda yara iyileşmesi yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu üzerinde de, normal fareler şifa yara yara kasılması, temel alır. Genellikle, kemirgen modellerinde kullanılan yara splint yara daralma en aza indirmek için yardımcı olur ve yaralar diyabetik Sıçanlarda neredeyse tamamen daralma tarafından kapatılır, ancak granülasyon dokusu17, kademeli oluşumu için sağlar. Ancak, daralma diyabetik yara ZDF içinde fareler Engelli ve öncelikle şifa yara oluşur yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu; Bu nedenle, bu işlem daha14şifa insan yara benzerdir.

Debridman sık karşılaşılan sonra klinik olarak maruz kalan kemik ile diyabetik yaralar. Önceki çalışmalarda 12 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları korele çıplak fareler18,19 sırtında ve 10 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları normal farelere20sırtında inceledik. Şiddetli diyabetik yaralar için klinik bir model geliştirmek için daha büyük (15 x 10 mm2) tam kalınlıkta deri kusurları ile kemik maruz ve kapaklarini olarak yukarıda açıklanan21, tip 2 diyabet ve obezite ile Sıçanlarda oluşturulan.

Sıçan ASC (rASC) normal Lewis sıçan ASCs sayfalarından ASC sayfaları allojenik nakli oluşturulmuştur. Diyabetik hastalarda ülser kez kontrolsüz yüksek kan şekeri ve yüksek vücut kitle endeksi ve yağ dokusu bu hastalardan elde etme zorluğu artırmak bu komplikasyonlar neden yara iyileşmesi bozukluklar gibi ağır diyabetik komplikasyonlar sergilemek çünkü klinik uygulamada, Otolog transplantasyon olanaksız. Ayrıca, ASCs diyabet sergi ile hayvanlardan özellikleri değişmiş ve işlev22Engelli. Bu nedenle, normal sıçanlar rASC sayfalarından allojenik nakli ve Yapay cilt uygulamaya diyabetik sıçan burada sunulan protokolünü açıklar.

Bu protokol için kullanılan bilayer Yapay deri yaraları spontan daralma engeller, yeni bir bağ dokusu matris sentezini teşvik ve gerçek DermIS23benzer. Bu protokol için yapay deri bir rASC sayfaya yerleştirilen ve yara daralma veya gevşek sıçan derisinden kaynaklanan genişleme önlemek için naylon konu ile sabit. Buna ek olarak, suni deri için ASC yaprak üç boyutlu bir çerçeve sağlar, transplante ASC sayfaları ve yaralar için nemli bir ortamın yaratıldığı ve yaralar enfeksiyon ve dış güçler korur. Son olarak, yapışkan olmayan soyunma dış etki korumak, nemli yara ortamı korumak ve çıktı absorbe yara yerleştirilir.

Bir rASC sac ince, esnek ve deforme ve dayak kalp24gibi alıcı siteler hareket için yapıştırılır. Hücre sayfalık mühendislik çeşitli dokuların yeniden inşası için kullanılan ve iyileştirici etkileri25,26. -ebilmek oluşturmak Klinik tedavi potansiyel sergi ASC sayfaları yaralar birçok türleri konusunda bilgi sahibi şifa hızlandırmak. Ayrıca, allojeneik nakli ASC yaprak, suni deri, kullanımı ile kombine tedaviye dirençli ülser veya burns, bu periferik arter hastalığı veya kollajen hastalığı, gözlenen gibi geçerli olabilir veya Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Bu yaklaşım ASCs nakli verimliliğini artırır. Yara iyileşmesi ZDF fare modeli işlem şifa insan yara benzer ve küçük ölçekli deneysel hayvan klinik koşullarda taklit eden bir ağır yara koşul üretir.

Protokol

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women's Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.

1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes

  1. Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 °C until use.
  2. Use adult male ZDF rats as a type 2 diabetic obesity model. Use the fat pad of male Lewis rats to isolate adipose tissue to prepare the cell sheets.

2. Isolation and Culture of rASCs

  1. Obtain adipose tissue from Lewis rats (8 - 33 weeks old, male) under general anesthesia using isoflurane.
    1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and a 5-0 nylon suture. Sterilize the surgical instruments and supplies.
    2. Prepare a 100-mm Petri dish with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) to temporarily preserve the obtained adipose tissue. Weigh the Petri dish with PBS using a balance before starting surgery to measure the collected adipose tissue. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
    3. Anesthetize the rats by using isoflurane at 3 - 4% via a rodent mechanical ventilator and maintain the rats at 2 - 3% isoflurane during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat.
    4. While wearing sterile gloves, position the rat in a supine position on a sterile drape. Shave the operative area with an electric razor and clean the abdominal section of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
    5. Create an approximately 5 cm-long skin incision with a scalpel in the lateral lower abdomen of the rat. Expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis. Gently pull the epididymal adipose tissue out.
      NOTE: The adipose tissue can be obtained on either side of the rat's abdomen.
    6. Excise only the epididymal adipose tissue, avoiding damage to the epididymis, testis, and epididymal blood vessels (Figure S1). Soak the excised adipose tissue in the PBS in the Petri dish to prevent dryness and weigh the tissue.
    7. Close the abdominal muscle with 5-0 VICRYL and the skin with a 5-0 nylon suture. Then, return each rat that has undergone surgery to a separate cage (one rat per cage).
      NOTE: Monitor the rats until they fully recover.
  2. Isolate rASCs from 2 - 3 g of adipose tissue (excised from a Lewis rat and processed according to a previously-reported method)27. Briefly, enzymatically digest the excised adipose tissue with 0.1% type A collagenase at 37 °C for 1 h to obtain the stromal-vascular fraction (SVF; Figure S2).
    1. Prepare several 100-µm cell strainers, several 50-mL tubes, several 15 mL tubes, and two scalpels on a biological clean bench. Turn on a centrifuge and warm up a water bath to 37 °C. In addition, prepare approximately 50 mL of sterile PBS in a 50 mL tube with 0.1% (final concentration) of type A collagenase.
    2. Mince the adipose tissue into small pieces using two scalpels.
    3. Move all minced adipose tissue to a 50-mL tube and add PBS to bring the total volume to 15 mL.
    4. Rest the 50-mL tube upright for 5 min. Discard the upper layer and collect the lower layer except for the debris.
    5. Add 0.1% of type A collagenase solution to the 50-mL tube with PBS containing the upper layer in order to enzymatically digest the adipose tissue.
      NOTE: Warm approximately 20 mL of PBS per 2 - 3 g of adipose tissue in a 37 °C water bath.
    6. Tilt and shake the 50 mL tube gently at 120 - 130 rpm for 1 h in a 37 °C water bath.
    7. Rest the 50 mL tube upright for 5 min after shaking.
    8. Filter the solution using a 100 µm cell strainer and pour the solution into a new 50 mL tube. Dispense the filtered solution into two 15 mL tubes.
    9. Centrifuge the solution in the 15 mL tubes for 5 min at 700 x g. Carefully remove the upper layer of supernatant and leave 5 mL of the lower layer of the solution. Do not aspirate the pellet.
    10. Add approximately 5 mL of complete culture medium to each 15 mL tube, up to 10 mL per 15 mL tube, and carefully re-suspend the pellet.
    11. Repeat steps 2.2.8 - 2.2.9. Then, obtain the SVF.
  3. Prepare two 60 cm2 culture dishes. Collect the SVF after two centrifugations at 700 × g for 5 min. Suspend the SVF and plate 10 mL of SVF solution on each 60-cm2 culture dish.
  4. Culture the dishes for 24 h at 37 °C in a 5% CO2 incubator.
  5. Prepare PBS and 0.25% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), storable for several months at 4 °C until use.
  6. After initial plating (24 h), wash the cells with PBS 3 times to remove unattached cells and debris. Add fresh complete medium.
  7. Passage the cells that are nearly sub-confluent on day 3. Add 1 mL of 0.25% trypsin-EDTA and incubate the cells at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 3 - 5 min.
    NOTE: Complete the trypsinization step within 10 min to prevent cell damage.
  8. Observe the cells under a light microscope after trypsinization to confirm that all the cells have thoroughly detached from the dishes. Then, add 9 mL of complete culture medium to the dishes.
  9. Count the number of cells using a hemocytometer.
  10. Subculture the cells at a density of 1.7 x 103 cells/cm2 every 3 days until passage 3. Culture the subcultured cells at 37 °C in the humidified atmosphere of a 5% CO2 incubator.

3. Creation of rASC Sheets

  1. Prepare several 35-mm diameter temperature-responsive culture dishes. Pre-coat the dishes with FBS (or complete medium containing FBS) at 37 °C in a 5% CO2 incubator for more than 1 h.
    NOTE: A 35 mm diameter temperature-responsive culture dish is a commercially available product.
  2. Prepare a thermo-plate and incubate at 37 °C for the following experimental procedures.
    NOTE: Perform every procedure using temperature-responsive culture dishes on a 37 °C thermo-plate to prevent the cells from spontaneously detaching from the dish.
    1. Warm the complete culture medium used in the procedures to 37 °C prior to experimentation.
    2. Seed passage 3 rASCs derived from Lewis rats onto a 35 mm diameter temperature-responsive culture dish at a density of 1.5 x 105 cells/dish for 3 days using a 2 mL total volume of complete culture medium.
      NOTE: When rASCs are plated onto a new culture dish, the dish should be slowly rocked back and forth and left and right in an incubator to achieve uniform rASC seeding and a uniformly thick rASC sheet.
    3. Change 2 mL of the medium to 2 mL of complete culture medium containing 16.4 µg/mL L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (AA) on day 3 after seeding to the temperature-responsive culture dishes incubated on a 37 °C thermo-plate.
      NOTE: Dissolved AA can be stored at -30 °C for months.
    4. Culture the cells for an additional 4 - 5 days and replace the medium every 2 days with fresh medium containing AA.
    5. Confirm the proliferation and generation of ASCs under a light microscope to determine whether gaps occurred between the cells in a contiguous cell sheet.
  3. Transfer the cell sheets from the incubator to the benchtop for 15 - 20 min to cool them to room temperature.; observe the cells spontaneously detach as a contiguous cell sheet. Harvest the rASC sheet from the dish surface with a pair of forceps.
    NOTE: Usually, rASC sheets can be handled with a pair of forceps. If necessary, a transfer membrane can be used to transfer a cell sheet from the culture dish to the wound site if the cell sheet is brittle and fragile.

4. Preparation of the Full-thickness Skin Defect Wound Model and Transplantation of rASC Sheets

  1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauze, 5-0 nylon suture, a scalpel, a periosteal raspatory, a needle holder, operating scissors, and a pair of forceps. Sterilize the surgical instruments and supplies. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
  2. Prepare PBS and maintain it at room temperature, along with some artificial skin and a non-adhesive dressing. Precut the artificial skin (15 x 10 mm) and non-adhesive dressing (20 × 15 mm). Soak the inner collagen sponge layer of the artificial skin in saline before using the artificial skin.
    NOTE: The artificial skin is made of two layers: an outer silicone sheet layer and an inner collagen sponge.
  3. Use ZDF rats (16 - 18 weeks old, male, 500 - 600 g) as a wound-healing model for type 2 diabetes and obesity.
  4. Anesthetize the ZDF rats by inhalation of 4% isoflurane using a rodent mechanical ventilator. Induce anesthesia by using isoflurane at 4 - 5% via a rodent mechanical ventilator and maintain it at 3 - 4% during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat via a toe pinch.
  5. While wearing sterile gloves, position the rat in the prone position on a sterile drape. Clean the head of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol, shave the operative area with an electric razor, and clean the skin after shaving using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
  6. Create a squared full-thickness skin defect (15 x 10 mm2) on the head of the anesthetized ZDF rats by removing the cutaneous tissue from the epidermis to the periosteum. Excise the skin and cutaneous tissue with a scalpel and remove the periosteum with a periosteal raspatory.
  7. Move the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish from the incubator to a room-temperature environment immediately prior to transplantation.
  8. Observe the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish spontaneously detach as a sheet from the dish surface after the formation of a wound. Harvest the rASC sheets after 7 days of culturing on temperature-responsive culture dishes. Remove the cultured medium and wash the rASC sheet with PBS three times. Soak the rASC sheet in PBS until transplantation to prevent desiccation.
  9. Place the rASC sheet immediately over the skull defect using a pair of forceps. If the cell sheet is brittle and fragile, a membrane can be used as a scaffold for transferring the cell sheet from the culture dish to the wound site.
  10. Cover the rASC sheet and defect with the artificial skin (15 x 10 mm2) and close the wound with approximately 10 stiches using the 5-0 nylon suture. To protect the wound, place a non-adhesive dressing (20 x 15 mm2) over the artificial skin, using 5-0 nylon sutures to keep the wound environment moist and to absorb exudates.
    NOTE: The non-adhesive dressings will be removed by the ZDF rats within a few days after application. Therefore, it is necessary to regularly monitor the rats after transplantation. Usually, the non-adhesive dressing is replaced every 2 days under general anesthesia.
  11. Return each rat that has undergone surgery to a separate cage until they have fully recovered (one rat per cage). After an observation period, euthanize the rats using the approved method of isoflurane overdose.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı bir yeni hücre tabanlı terapi dirençli diyabetik yaralar için kurmak çalıştı. (Olarak şekil 1' deki resimli), kısaca allojeneik rASC sayfaları normal sıçanlarından emir hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulmuş ve sonra suni deri üzerine bir tam kalınlıkta deri kusur bilayer bir diyabetik sıçan kullanarak nakledilmektedir. İyi bir örnek bir rASC sayfasının (şekil 2A) ve kötü bir örnek bir rA...

Tartışmalar

Bir rASC sayfası başarıyla kültür için en kritik adımlar şunlardır: 1) sıcaklık sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kültür sırasında yaklaşık olarak 37 ° C'de saklanması gerekir. Bir rASC sayfası oluşturma sırasında her yordam 37 ° C termo-plaka üzerinde gerçekleştirilmiş ve her reaktif kendiliğinden çanak31ayırma hücreleri önlemek için 37 ° c ısıttı. 2) alıcı ZDF fareler rASC sayfaları başarılı ekimi için kritik olmayan yapışkan soyunma kaldırıl...

Açıklamalar

Finansal ilişkileri bu yayın için ilgili aşağıdaki yazarlar ifşa: Teruo Okano kurucusu ve Yöneticisi, teknoloji ve patent Tokyo kadın Tıp Üniversitesi'nden lisans verir, hücre tohum Inc.'in yönetim kurulu ve Teruo Okano ve Masayuki Yamato paydaşların hücre tohum A.ş Tokyo kadın Tıp Üniversitesi Araştırma Fonu hücre tohum Inc alır Diğer yazarlar onlar finansal ilişkileri bu yayına ilgili yok bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Dr Yukiko Koga bölümü plastik ve Rekonstrüktif cerrahi, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi, pratik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Biz de Bay Hidekazu Murata diyabetik Merkezi, Tokyo kadın Tıp Üniversitesi Tıp Fakültesi mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışmada oluşturma yenilik merkezleri tarafından gelişmekte olan yenilik sistemleri "hücre sayfası doku Mühendisliği Merkezi (CSTEC)" için projenin disiplinler arası araştırma alanları programı gelişmiş için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT) Japonya'nın desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicillin/streptomycinLife Technologies15140-122
Collagenase ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Germany
60-cm2 Primaria tissue culture dishBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)Life Technologies1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Life Technologies25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrateWako013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd.1111
Rodent mechanical ventilatorStoelting#50206Wood Dale, IL
4% isofluranePfizer Japan114-13340-3Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®)Smith & NephewPN-R40060 Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®)Smith & Nephew66800679Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon sutureAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15mL Centrifuge TubeCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Referanslar

  1. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  2. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  4. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  5. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  6. Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  7. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  8. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  9. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  10. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  11. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  12. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  13. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  14. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  15. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  16. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  17. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  18. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  19. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  20. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  21. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  22. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  23. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  24. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  25. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  26. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  27. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  28. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  29. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  30. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 126h cre sacya kaynakl k k h creMezenkimal K k h creyara iyile mesinaklis anya dokusu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır