Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Resumen

Células madre procedentes de adiposo (ASCs) son fácilmente aisladas y extraídas de la grasa de las ratas normales. Hojas de ASC pueden crearse utilizando ingeniería hoja de la célula y pueden ser transplantadas en Zucker ratas diabéticas grasosas exhibiendo espesor total defectos con hueso expuesto de la piel y luego se cubrieron con una bicapa de piel artificial.

Resumen

Piel artificial ha logrado considerables resultados terapéuticos en la práctica clínica. Sin embargo, tratamientos de piel artificial para las heridas en pacientes diabéticos con flujo sanguíneo impedida o con heridas grandes podrían ser prolongados. Terapias basadas en células han aparecido como una nueva técnica para el tratamiento de las úlceras diabéticas, y hoja de la célula Ingeniería ha mejorado la eficacia del trasplante de la célula. Varios informes han sugerido que células madre procedentes de adiposo (ASCs), un tipo de células mesenquimales estromales (MSC), exhiben potencial terapéutico debido a su relativa abundancia en el tejido adiposo y su accesibilidad para la recolección en comparación con MSCs de otros tejidos. Por lo tanto, ASCs parecen ser una buena fuente de células madre para uso terapéutico. En este estudio, hojas ASC de la grasa adiposa Epididimal de las ratas de Lewis normales fueron creadas con éxito utilizando platos de cultivo temperatura sensible y normal medio de cultivo que contiene ácido ascórbico. Las hojas ASC fueron transplantadas en ratas diabéticas grasos (ZDF) de Zucker, un modelo de diabetes tipo 2 y obesidad, que muestran disminución de ratas la cicatrización de heridas. Una herida fue creada en la superficie craneal posterior, hojas ASC se trasplantaron en la herida y la piel de una bicapa artificial fue utilizada para cubrir las hojas. Las ratas ZDF que recibieron hojas ASC habían mejor cicatrización que las ratas ZDF sin el trasplante de las hojas de la ASC. Este enfoque fue limitado porque las hojas de ASC son sensibles a las condiciones secas, requiriendo el mantenimiento de un entorno húmedo de la herida. Por lo tanto, la piel artificial fue utilizada para cubrir la hoja de la ASC para evitar que se sequen. El trasplante alógeno de hojas ASC en combinación con piel artificial también podría ser aplicable a otras úlceras intratables o quemaduras, como los observados con la enfermedad arterial periférica y enfermedad del colágeno y puede ser administrado a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Así, este tratamiento podría ser el primer paso hacia la mejora de las opciones terapéuticas para el diabético herida curativo.

Introducción

La población de pacientes diabéticos está aumentando en todo el mundo y llegó a 400 millones en el 2015¹; aproximadamente 15-25% de pacientes con diabetes están en riesgo de la progresión de una úlcera diabética de extremidades inferiores². Las úlceras diabéticas de la extremidad inferior son insuperables y podrían requerir un período terapéutico prolongado con entrenamiento de rehabilitación después de una recuperación completa. Un período largo de la terapia a menudo resulta en una reducción significativa en la paciente calidad de vida. Así, hay que desarrollar nuevas terapias que disminuirán o impedir la agravación para el tratamiento de las heridas diabéticas. Para evaluar la cicatrización de la herida diabética, hemos optimizado una úlcera diabética cicatrización modelo en ratas, que imita las condiciones clínicas prácticas, y evaluó si el transplante de células madre derivadas de adiposo (ASC) hojas utilizando ingeniería hoja de la célula acelerado la cicatrización de heridas.

Las células estromales mesenquimales (MSCs) presentan un excelente potencial para acelerar la cicatrización de heridas por su capacidad de auto renovación, por sus efectos inmunomoduladores y su capacidad de diferenciarse en varios linajes de células³. ASCs son un tipo de MSC derivada de tejido adiposo, y presentan varias ventajas sobre los MSCs derivadas de otros tejidos, incluyendo su potencial angiogénico y paracrina actividad^4,5. Tejido adiposo es relativamente abundante en el cuerpo humano, y su accesibilidad permite colección mediante procedimientos mínimamente invasivos. Por lo tanto, se han utilizado experimentalmente ASCs para cicatrización aplicaciones^6,7.

Informes anteriores han demostrado que la inyección directa de suspensiones MSC unicelular en áreas alrededor de las heridas puede acelerar la cicatrización en^8,9. Sin embargo, a pesar de informes de la aceleración de la cicatrización de heridas en los modelos de úlcera diabética después de la inyección de suspensiones celulares solo, no está claro el tiempo de supervivencia de las células trasplantadas en el sitio de la herida.

En este estudio, aplicamos ingeniería hoja de la célula usando platos de cultura sensible a la temperatura. Estos platos tienen la temperatura sensible polímero N- isopropylacrylamide covalentemente a su superficie¹⁰. La capa de polímero injertado permite la adhesión celular con control de temperatura a o desprendimiento de la superficie de la placa de cultivo. La superficie del plato se vuelve hidrofóbica a 37 ° C, permitiendo que las células para adherirse y proliferar, mientras que las células suelte espontáneamente de la superficie cuando se vuelve hidrófilo a temperaturas por debajo de 32 ° C. Las células cultivadas se pueden cosechar como una hoja de celdas contiguas con uniones célula a célula intactas y matrices extracelulares (ECMs) simplemente mediante la reducción de la temperatura; así, las enzimas proteolíticas que dañan el ECM, como la tripsina, no son necesarios¹¹. Por lo tanto, ingeniería hoja de la célula puede preservar las conexiones de la célula a célula y mejorar la eficacia del trasplante de la célula.

Además, trasplante de la hoja de la célula aumenta las tasas de supervivencia de la célula en comparación con la célula de inyección¹². En este protocolo, Zucker ratas diabéticas de (ZDF) grasosas fueron seleccionadas como un modelo de obesidad y diabetes tipo 2 con retraso de la cicatrización de heridas. Las ratas ZDF espontáneamente desarrollan obesidad en aproximadamente 4 semanas. Luego desarrollan diabetes tipo 2 con obesidad entre 8 y 12 semanas de edad, momento en el que exhiben hiperglucemia asociada con insulina resistencia, dislipemia e hipertrigliceridemia¹³. Retraso herida que cura, reducción del flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos periféricos y la nefropatía diabética también se observan^14,15,16. Además, las ratas ZDF podrían ser un modelo apropiado para el estudio de la curación de las úlceras cutáneas intratables, como las úlceras diabéticas.

Las diferencias entre los seres humanos y roedores en los mecanismos de cicatrización se asocian a las diferencias anatómicas en la piel. Herida que cura en ratas normales se basa en la contracción de la herida, mientras que la cicatrización de heridas en seres humanos se basa en la formación de tejido de granulación y reepitelización. Por lo general, herida ferulización utilizado en modelos de roedores ayuda a minimizar la contracción de la herida y permite la formación gradual de tejido de granulación¹⁷, aunque las heridas en diabéticos ratas son casi completamente cerradas por contracción. Sin embargo, el diabético herida contracción en ZDF ratas se deteriora, y cicatrizantes sobre todo se produce a través de reepitelización y formación de tejido de granulación; así, este proceso es más similar a la cicatrización humana¹⁴.

Diabéticas heridas con hueso expuesto después de desbridamiento se encuentran a menudo clínicamente. Estudios previos han examinado las heridas de piel de espesor total de 12 mm de diámetro sobre las espaldas de athymic mice desnudas^18,19 y heridas de la piel de espesor total de 10 mm de diámetro sobre las espaldas de los ratones normales²⁰. Para desarrollar un modelo clínico para heridas diabéticas severas, defectos más grandes de piel de espesor total (15 x 10 mm²) con exponen hueso y sin el periostio se crearon, como se describió anteriormente²¹, en ratas con diabetes tipo 2 y obesidad.

Hojas ASC (rASC) rata de ASCs de ratas Lewis normales fueron creadas por el trasplante alógeno de hojas ASC. En la práctica clínica, el trasplante autólogo es inviable porque los pacientes diabéticos con úlceras a menudo exhiben graves complicaciones diabéticas, como niveles de glucosa sanguínea alta sin control, índices de masa corporal alta y estos complicaciones causa cicatrización los trastornos que aumentan la dificultad de obtención de tejido adiposo de estos pacientes. Además, ASCs de animales con exposición de diabetes alteración propiedades y deterioraron función²². Por lo tanto, el protocolo que presentamos describe el trasplante alógeno de rASC hojas de ratas normales y la aplicación de piel artificial a ratas diabéticas.

La piel artificial de dos capas usada en este protocolo evita la contracción espontánea de las heridas, promueve la síntesis de una nueva matriz de tejido conectivo y se asemeja a la verdadera dermis²³. En el presente Protocolo, la piel artificial se coloca en una hoja de rASC y fijo con hilos de nylon para evitar la contracción de la herida o ampliación resultante de piel de rata suelta. Además, la piel artificial proporciona un marco tridimensional para las hojas de la ASC, mantiene un ambiente húmedo para el trasplantado hojas ASC y heridas y protege las heridas de la infección y las fuerzas externas. Finalmente, se coloca un apósito no adhesivo sobre la herida para protegerla del impacto externo, mantener un ambiente húmedo de la herida y absorber el exudado.

Una hoja de rASC es fina, flexible y deformable y puede adherir a sitios receptores, como un latido corazón²⁴en movimiento. Ingeniería de la hoja de la célula se ha utilizado para la reconstrucción de varios tejidos y puede generar efectos curativos^25,26. Hojas ASC que exhiben potencial clínico terapéutico podrían acelerar la curación de muchos tipos de heridas. Además, el trasplante alogénico de las hojas de la ASC, combinado con el uso de piel artificial, podría ser aplicable al tratamiento de las úlceras intratables o quemaduras, como los observados en la enfermedad arterial periférica o enfermedad del colágeno, o puedan ser administrados a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Este enfoque aumenta la eficacia del trasplante ASC. El modelo de rata ZDF cicatrización produce una condición de la herida grave que se asemeja el proceso de cicatrización humana y simula las condiciones clínicas en un animal experimental pequeño.

Protocolo

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women's Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.

1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes

1. Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 °C until use.
2. Use adult male ZDF rats as a type 2 diabetic obesity model. Use the fat pad of male Lewis rats to isolate adipose tissue to prepare the cell sheets.

2. Isolation and Culture of rASCs

1. Obtain adipose tissue from Lewis rats (8 - 33 weeks old, male) under general anesthesia using isoflurane.
   1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and a 5-0 nylon suture. Sterilize the surgical instruments and supplies.
   2. Prepare a 100-mm Petri dish with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) to temporarily preserve the obtained adipose tissue. Weigh the Petri dish with PBS using a balance before starting surgery to measure the collected adipose tissue. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
   3. Anesthetize the rats by using isoflurane at 3 - 4% via a rodent mechanical ventilator and maintain the rats at 2 - 3% isoflurane during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat.
   4. While wearing sterile gloves, position the rat in a supine position on a sterile drape. Shave the operative area with an electric razor and clean the abdominal section of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
   5. Create an approximately 5 cm-long skin incision with a scalpel in the lateral lower abdomen of the rat. Expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis. Gently pull the epididymal adipose tissue out.
      NOTE: The adipose tissue can be obtained on either side of the rat's abdomen.
   6. Excise only the epididymal adipose tissue, avoiding damage to the epididymis, testis, and epididymal blood vessels (Figure S1). Soak the excised adipose tissue in the PBS in the Petri dish to prevent dryness and weigh the tissue.
   7. Close the abdominal muscle with 5-0 VICRYL and the skin with a 5-0 nylon suture. Then, return each rat that has undergone surgery to a separate cage (one rat per cage).
      NOTE: Monitor the rats until they fully recover.
2. Isolate rASCs from 2 - 3 g of adipose tissue (excised from a Lewis rat and processed according to a previously-reported method)²⁷. Briefly, enzymatically digest the excised adipose tissue with 0.1% type A collagenase at 37 °C for 1 h to obtain the stromal-vascular fraction (SVF; Figure S2).
   1. Prepare several 100-µm cell strainers, several 50-mL tubes, several 15 mL tubes, and two scalpels on a biological clean bench. Turn on a centrifuge and warm up a water bath to 37 °C. In addition, prepare approximately 50 mL of sterile PBS in a 50 mL tube with 0.1% (final concentration) of type A collagenase.
   2. Mince the adipose tissue into small pieces using two scalpels.
   3. Move all minced adipose tissue to a 50-mL tube and add PBS to bring the total volume to 15 mL.
   4. Rest the 50-mL tube upright for 5 min. Discard the upper layer and collect the lower layer except for the debris.
   5. Add 0.1% of type A collagenase solution to the 50-mL tube with PBS containing the upper layer in order to enzymatically digest the adipose tissue.
      NOTE: Warm approximately 20 mL of PBS per 2 - 3 g of adipose tissue in a 37 °C water bath.
   6. Tilt and shake the 50 mL tube gently at 120 - 130 rpm for 1 h in a 37 °C water bath.
   7. Rest the 50 mL tube upright for 5 min after shaking.
   8. Filter the solution using a 100 µm cell strainer and pour the solution into a new 50 mL tube. Dispense the filtered solution into two 15 mL tubes.
   9. Centrifuge the solution in the 15 mL tubes for 5 min at 700 x g. Carefully remove the upper layer of supernatant and leave 5 mL of the lower layer of the solution. Do not aspirate the pellet.
   10. Add approximately 5 mL of complete culture medium to each 15 mL tube, up to 10 mL per 15 mL tube, and carefully re-suspend the pellet.
   11. Repeat steps 2.2.8 - 2.2.9. Then, obtain the SVF.
3. Prepare two 60 cm² culture dishes. Collect the SVF after two centrifugations at 700 × g for 5 min. Suspend the SVF and plate 10 mL of SVF solution on each 60-cm² culture dish.
4. Culture the dishes for 24 h at 37 °C in a 5% CO₂ incubator.
5. Prepare PBS and 0.25% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), storable for several months at 4 °C until use.
6. After initial plating (24 h), wash the cells with PBS 3 times to remove unattached cells and debris. Add fresh complete medium.
7. Passage the cells that are nearly sub-confluent on day 3. Add 1 mL of 0.25% trypsin-EDTA and incubate the cells at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 3 - 5 min.
   NOTE: Complete the trypsinization step within 10 min to prevent cell damage.
8. Observe the cells under a light microscope after trypsinization to confirm that all the cells have thoroughly detached from the dishes. Then, add 9 mL of complete culture medium to the dishes.
9. Count the number of cells using a hemocytometer.
10. Subculture the cells at a density of 1.7 x 10³ cells/cm² every 3 days until passage 3. Culture the subcultured cells at 37 °C in the humidified atmosphere of a 5% CO₂ incubator.

3. Creation of rASC Sheets

1. Prepare several 35-mm diameter temperature-responsive culture dishes. Pre-coat the dishes with FBS (or complete medium containing FBS) at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for more than 1 h.
   NOTE: A 35 mm diameter temperature-responsive culture dish is a commercially available product.
2. Prepare a thermo-plate and incubate at 37 °C for the following experimental procedures.
   NOTE: Perform every procedure using temperature-responsive culture dishes on a 37 °C thermo-plate to prevent the cells from spontaneously detaching from the dish.
   1. Warm the complete culture medium used in the procedures to 37 °C prior to experimentation.
   2. Seed passage 3 rASCs derived from Lewis rats onto a 35 mm diameter temperature-responsive culture dish at a density of 1.5 x 10⁵ cells/dish for 3 days using a 2 mL total volume of complete culture medium.
      NOTE: When rASCs are plated onto a new culture dish, the dish should be slowly rocked back and forth and left and right in an incubator to achieve uniform rASC seeding and a uniformly thick rASC sheet.
   3. Change 2 mL of the medium to 2 mL of complete culture medium containing 16.4 µg/mL L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (AA) on day 3 after seeding to the temperature-responsive culture dishes incubated on a 37 °C thermo-plate.
      NOTE: Dissolved AA can be stored at -30 °C for months.
   4. Culture the cells for an additional 4 - 5 days and replace the medium every 2 days with fresh medium containing AA.
   5. Confirm the proliferation and generation of ASCs under a light microscope to determine whether gaps occurred between the cells in a contiguous cell sheet.
3. Transfer the cell sheets from the incubator to the benchtop for 15 - 20 min to cool them to room temperature.; observe the cells spontaneously detach as a contiguous cell sheet. Harvest the rASC sheet from the dish surface with a pair of forceps.
   NOTE: Usually, rASC sheets can be handled with a pair of forceps. If necessary, a transfer membrane can be used to transfer a cell sheet from the culture dish to the wound site if the cell sheet is brittle and fragile.

4. Preparation of the Full-thickness Skin Defect Wound Model and Transplantation of rASC Sheets

1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauze, 5-0 nylon suture, a scalpel, a periosteal raspatory, a needle holder, operating scissors, and a pair of forceps. Sterilize the surgical instruments and supplies. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
2. Prepare PBS and maintain it at room temperature, along with some artificial skin and a non-adhesive dressing. Precut the artificial skin (15 x 10 mm) and non-adhesive dressing (20 × 15 mm). Soak the inner collagen sponge layer of the artificial skin in saline before using the artificial skin.
   NOTE: The artificial skin is made of two layers: an outer silicone sheet layer and an inner collagen sponge.
3. Use ZDF rats (16 - 18 weeks old, male, 500 - 600 g) as a wound-healing model for type 2 diabetes and obesity.
4. Anesthetize the ZDF rats by inhalation of 4% isoflurane using a rodent mechanical ventilator. Induce anesthesia by using isoflurane at 4 - 5% via a rodent mechanical ventilator and maintain it at 3 - 4% during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat via a toe pinch.
5. While wearing sterile gloves, position the rat in the prone position on a sterile drape. Clean the head of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol, shave the operative area with an electric razor, and clean the skin after shaving using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
6. Create a squared full-thickness skin defect (15 x 10 mm²) on the head of the anesthetized ZDF rats by removing the cutaneous tissue from the epidermis to the periosteum. Excise the skin and cutaneous tissue with a scalpel and remove the periosteum with a periosteal raspatory.
7. Move the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish from the incubator to a room-temperature environment immediately prior to transplantation.
8. Observe the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish spontaneously detach as a sheet from the dish surface after the formation of a wound. Harvest the rASC sheets after 7 days of culturing on temperature-responsive culture dishes. Remove the cultured medium and wash the rASC sheet with PBS three times. Soak the rASC sheet in PBS until transplantation to prevent desiccation.
9. Place the rASC sheet immediately over the skull defect using a pair of forceps. If the cell sheet is brittle and fragile, a membrane can be used as a scaffold for transferring the cell sheet from the culture dish to the wound site.
10. Cover the rASC sheet and defect with the artificial skin (15 x 10 mm²) and close the wound with approximately 10 stiches using the 5-0 nylon suture. To protect the wound, place a non-adhesive dressing (20 x 15 mm²) over the artificial skin, using 5-0 nylon sutures to keep the wound environment moist and to absorb exudates.
    NOTE: The non-adhesive dressings will be removed by the ZDF rats within a few days after application. Therefore, it is necessary to regularly monitor the rats after transplantation. Usually, the non-adhesive dressing is replaced every 2 days under general anesthesia.
11. Return each rat that has undergone surgery to a separate cage until they have fully recovered (one rat per cage). After an observation period, euthanize the rats using the approved method of isoflurane overdose.

Resultados

Este protocolo intentó establecer una nueva terapia celular para las heridas diabéticas insuperables. Brevemente (como se ilustra en la figura 1), hojas de allogeneic rASC fueron creadas de las ratas normales utilizando ingeniería hoja de la célula y luego fueron trasplantadas con una bicapa de piel artificial a un defecto de piel de espesor total en una rata diabética. Imágenes de microscopio de luz de un buen ejemplo de una hoja de rASC (figura 2A...

Discusión

Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de una hoja de rASC son los siguientes: 1) la temperatura debe mantenerse a unos 37 ° C durante el cultivo en los platos de la cultura sensible a la temperatura. Durante la creación de una hoja de rASC, cada procedimiento fue realizado en una placa térmica de 37 ° C, y cada reactivo fue calentado a 37 ° C para evitar que las células espontáneamente extracción desde el plato³¹. 2) las ratas ZDF destinatarias deben controlarse para evitar l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM glutamax	Invitrogen	32571-036	Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS)	Japan Bioserum Co Ltd.	S1650-500
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Collagenase A	Roche Diagnostics	10 103 578 001	Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish	BD Biosciences	353803	Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)	Life Technologies	1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Life Technologies	25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate	Wako	013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)	CellSeed	NUNC-174904	Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000)	Kitazato Science Co., Ltd.	1111
Rodent mechanical ventilator	Stoelting	#50206	Wood Dale, IL
4% isoflurane	Pfizer Japan	114-13340-3	Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®)	Smith & Nephew	PN-R40060	Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®)	Smith & Nephew	66800679	Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES	greiner bio-one	227 261
15 mL Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL	Hu-Friedy	P14	Chicago, IL