יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Summary

נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים) בקלות מבודדים, שנקטפו השומן של חולדות רגילה. גליונות ASC יכולים להיווצר באמצעות הנדסה תא גיליונות, יכול להיות מושתלים לתוך צוקר סוכרתית חולדות שומני מפגין מלא-עובי העור פגמים עם עצם חשופה והן מכוסות bilayer של עור מלאכותי.

Abstract

עור מלאכותי השיג תוצאות טיפוליות ניכר בפרקטיקה הקלינית. עם זאת, עור מלאכותי טיפולים עבור פצעים בחולי סוכרת עם זרימת הדם המניע או עם פצעים גדולים עשוי להיות ממושך. טיפולים מבוססי תאים הופיעו גם טכניקה חדשה לטיפול של כיבים סוכרתיים, הנדסה תא גיליונות שיפרה את היעילות של השתלת תא. מספר דוחות הראו כי נגזר שומן בתאי גזע (השיקופיים), סוג של תא mesenchymal סטרומה (MSC), נספח הפוטנציאל הטיפולי בשל השפע היחסי שלהם רקמת שומן, שלהם נגישות עבור אוסף בהשוואה ל- MSCs של רקמות אחרות. לכן, השיקופיים להיראות מקור טוב של תאי גזע לשימוש טיפולית. במחקר זה, גליונות עולה מן השומן אדיפוז epididymal של חולדות לואיס רגילה נוצרו בהצלחה באמצעות בינוני תרבות רגיל המכיל חומצה אסקורבית ומנות טמפרטורה מגיב תרבות. הסדינים ASC היו מושתלים לתוך צוקר שומן סוכרתית (ZDF) חולדות, מודל עכברוש של סוכרת מסוג 2 והשמנת, כי התערוכה מופחתת ריפוי פצעים. פצע נוצר על פני הגולגולת האחורי ASC הסדינים היו מושתלים לתוך הפצע, עור מלאכותי bilayer שימש כדי לכסות את הסדינים. ZDF חולדות שקיבלו ASC גליונות כדאי היה פצע ריפוי מחולדות ZDF ללא השתלת גיליונות ASC. גישה זו הייתה מוגבלת מכיוון ASC גליונות רגישים לתנאי יובש, המחייב שמירה על סביבה לחה הפצע. לכן, עור מלאכותי שימש כדי לכסות את הגיליון ASC כדי למנוע התייבשות. השתלת allogenic של גיליונות ASC בשילוב עם עור מלאכותי עשוי גם להיות רלוונטי סורר כיבים או כוויות, כגון אלה נצפו עם מחלת עורקים היקפיים ומחלות קולגן, אחרים ו יכול להיות מנוהל על מנת חולים אשר אתה סובל מתת תזונה או נמצאים באמצעות סטרואידים. לכן, טיפול זה יכול להיות הצעד הראשון לקראת שיפור האפשרויות הטיפוליות עבור סוכרת פצע ריפוי.

Introduction

אוכלוסיית חולי סוכרת היא הגוברת ברחבי העולם והגיע 400 מיליון בשנת 2015¹; אומדן 15-25% של חולי סוכרת נמצאים בסיכון של ההתקדמות של כיב סוכרתי התחתונה-הגפיים². כיבים סוכרתיים התחתונה-הגפיים סורר, עשוי לדרוש הממושכת טיפולית עם הדרכה שיקומית לאחר התאוששות מלאה. תקופה ארוכה טיפול לעיתים קרובות גורמת לירידה משמעותית באיכות החיים המטופל. לפיכך, יש לפתח טיפולים חדשים להקטין או למנוע עוגמת נפש לטיפול פצעי סוכרת. כדי להעריך את ריפוי הפצע סוכרתית, אנחנו ממוטב כיב סוכרתי ריפוי פצע מודל בחולדות, אשר מחקה תנאים קליניים מעשיים, להעריך אם משתילים גליונות נגזר שומן בתאי גזע (ASC) באמצעות הנדסה תא גיליונות מואצת פצע ריפוי.

Mesenchymal תאי סטרומה (MSCs) התערוכה של פוטנציאל מצוין עבור האצת ריפוי הפצע בשל יכולת התחדשות עצמית שלהם, אפקטים immunomodulatory שלהם, יכולתם להבדיל לתוך התא השונים שושלות³. השיקופיים הם סוג של MSC נגזר רקמת שומן, שהם מייצגים את מספר יתרונות על פני MSCs נגזר רקמות אחרות, כולל שלהם האנגיוגנזה פוטנציאליים, paracrine פעילות^4,5. רקמת שומן יחסית שופע בגוף האדם, הנגישות שלה מאפשר איסוף באמצעות הליכים פולשנית. לכן, השיקופיים שימשו השפעול של ריפוי פצע יישומים^6,7.

בדו"חות קודמים הראו כי הזרקה ישירה של תא בודד MSC המתלים לאזורים סביב הפצעים יכולים להאיץ את^8,9ריפוי הפצע. עם זאת, למרות דיווחים על ההאצה של ריפוי פצעים כיב סוכרתי דגמים לאחר ההזרקה של תא בודד המתלים, הפעם הישרדות התאים המושתלים באתר הפצע אינו ברור.

במחקר זה, אנחנו מוחלים הנדסה תא גיליונות באמצעות תרבות טמפרטורה מגיב מנות. הכלים האלה יש את הטמפרטורה מגיב פולימר N- isopropylacrylamide covalently שמאוגד אל פני השטח שלהם,¹⁰. השכבה פולימר המושתל מאפשר תא מבוקרי טמפרטורה הדבקה על או ניתוק מפני השטח של המנה תרבות. פני השטח של המנה הופך הידרופובי ב 37 מעלות צלזיוס, ומאפשר תאים לדבוק ולאחר להתרבות, ואילו תאים לנתק באופן ספונטני מהמשטח לכשתהיה הידרופילית בטמפרטורה שמתחת 32 ° C. תאים בתרבית ניתן לקצור כמו סדין תא רציפים עם צמתי לתא ללא פגע, מטריצה חוץ-תאית (ECMs) פשוט על-ידי הפחתת הטמפרטורה; לפיכך, אנזימים הפרוטאוליטי נזק ECM, כמו טריפסין, אינם נדרשים¹¹. לכן, הנדסה תא גיליונות יכול לשמר חיבורים לתא ולשפר את היעילות של השתלת תא.

בנוסף, השתלת תאים גיליונות מגדילה תא שיעורי ההישרדות בהשוואה תא הזרקת¹². ב פרוטוקול זה, נבחרו צוקר סוכרתית שומניים (ZDF) חולדות כמודל סוג 2 סוכרת והשמנה עם ריפוי הפצע מושהית. חולדות ZDF להתפתח באופן ספונטני השמנת יתר בכ-4 שבועות. ואז הם לפתח סוכרת מסוג 2 עם השמנת יתר בין 8 ל 12 שבועות של גיל, באיזה שלב הם מציגים היפרגליקמיה המשויך אינסולין ההתנגדות, dyslipidemia וטריגליצרידים¹³. עיכוב ריפוי הפצע, זרימת דם מופחתת כלי דם היקפיים, סוכרת כלייתית גם הן נצפו^14,15,16. יתר על כן, ZDF חולדות עשוי להיות מודל המתאים עבור לימוד ריפוי של כיבים עורית סורר, כגון כיבים סוכרתיים.

ההבדלים בין בני אדם ומכרסמים מנגנוני ריפוי פצע משויכות הבדלים אנטומיים של העור. ריפוי אצל חולדות רגילה הפצע מבוסס על הפצע התכווצות, ואילו ריפוי הפצע בבני אדם מבוסס על היווצרות epithelialization מחדש רקמות פרור. בדרך כלל, הפצע לסדים. בשימוש במודלים מכרסמים מסייעת כדי למזער את הפצע התכווצות, מאפשר היווצרות הדרגתית של רקמות פרור¹⁷, למרות הפצעים בחולדות nondiabetic סגורים כמעט לגמרי על-ידי התכווצות. עם זאת, סוכרת פצע התכווצות ZDF חולדות הוא לקוי, ומתרחשת בעיקר ריפוי הפצע באמצעות epithelialization מחדש ויצירת רקמות פרור; לפיכך, תהליך זה דומה יותר ריפוי¹⁴הפצע האנושי.

פצעי סוכרת עם עצם חשופה לאחר הטריה לעיתים קרובות נתקל קלינית. מחקרים קודמים בחנו בקוטר 12 מ מ מלא-עובי העור פצעים על גבם של athymic עכברים עירום^18,19 ופצעים עור מלא-עובי 10 מ מ קוטר על גבם של עכברים רגילה²⁰. לפתח מודל קליני פצעי סוכרת חמורה, פגמים מלא-עובי העור (15 x 10 מ מ²) גדול יותר עם חשוף העצם ואת בלי קרום העצם נוצרו, כפי שתואר לעיל²¹, בחולדות עם סוכרת מסוג 2 והשמנת.

עכברוש גליונות עולה (rASC) מתוך השיקופיים של חולדות לואיס רגילה נוצרו לעבור השתלת allogenic של גיליונות ASC. באימון קליניים, השתלת עצמיים לא ילך, כי חולי סוכרת עם כיבים לעתים קרובות להפגין סיבוכים סוכרת חמורה, כגון רמות הגלוקוז בדם גבוהה לא מבוקרת ומדדי מסת גוף גבוה, סיבוכים כי ריפוי פצע הפרעות אלה המגבירים את הקושי בהשגת רקמת שומן מחולים אלה. יתר על כן, השיקופיים של בעלי חיים עם סוכרת בנספח לשנות מאפיינים, ליקויי תפקוד²². לכן, פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השתלת allogenic של rASC גיליונות של חולדות רגילה לבין היישום של עור מלאכותי חולדות סוכרתית.

העור המלאכותי bilayer בשימוש פרוטוקול זה מונע התכווצות ספונטנית של הפצעים, מקדם את סינתזת של מטריצה רקמת חיבור חדשה, דומה הדרמיס נכון²³. ב פרוטוקול זה, עור מלאכותי המוטלות על גיליון rASC, קבוע עם חוטי ניילון למניעת פצע התכווצות או התרחבות הנובע עור רופף עכברוש. בנוסף, העור המלאכותי מספקת מסגרת תלת-ממדי עבור הגליונות ASC שומרת על סביבה לחה ASC גליונות ופצעים המושתלים, מגן על הפצעים על זיהום, כוחות חיצוניים. לבסוף, ללא דבק ההלבשה מושם על הפצע כדי להגן עליו מפני השפעה חיצוניים, לשמור על סביבה לחה הפצע לספוג תפליט.

גיליון rASC רזה, גמיש ובעל deformable, יכול להיות דבקה העברת אתרים לנמען, כגון בגודל הלב הפועם²⁴. הנדסה תא גיליונות שימש את שיקומה של רקמות שונות, ניתן להפיק אפקטים המרפא^25,26. גליונות עולה כי התערוכה הפוטנציאל הטיפולי קליני שואלי ריפוי של סוגים רבים של פצעים. יתר על כן, השתלת allogeneic של גיליונות ASC, בשילוב עם השימוש של עור מלאכותי, עשוי להיות רלוונטי לטיפול בכיבים סורר או כוויות, כגון אלה הנהוגות מחלת עורקים היקפית או מחלות קולגן, או שהם עשויים להינתן לחולים אשר אתה סובל מתת תזונה או שימוש בסטרואידים. גישה זו מגדילה את היעילות של משתילים השיקופיים. המודל ריפוי פצע עכברוש ZDF מייצרת מצב פצע חמור דומה את תהליך ריפוי הפצע האנושי, מחקה תנאים קליניים בחיה ניסיוני בגודל קטן.

Protocol

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women's Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.

1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes

1. Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 °C until use.
2. Use adult male ZDF rats as a type 2 diabetic obesity model. Use the fat pad of male Lewis rats to isolate adipose tissue to prepare the cell sheets.

2. Isolation and Culture of rASCs

1. Obtain adipose tissue from Lewis rats (8 - 33 weeks old, male) under general anesthesia using isoflurane.
   1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and a 5-0 nylon suture. Sterilize the surgical instruments and supplies.
   2. Prepare a 100-mm Petri dish with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) to temporarily preserve the obtained adipose tissue. Weigh the Petri dish with PBS using a balance before starting surgery to measure the collected adipose tissue. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
   3. Anesthetize the rats by using isoflurane at 3 - 4% via a rodent mechanical ventilator and maintain the rats at 2 - 3% isoflurane during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat.
   4. While wearing sterile gloves, position the rat in a supine position on a sterile drape. Shave the operative area with an electric razor and clean the abdominal section of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
   5. Create an approximately 5 cm-long skin incision with a scalpel in the lateral lower abdomen of the rat. Expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis. Gently pull the epididymal adipose tissue out.
      NOTE: The adipose tissue can be obtained on either side of the rat's abdomen.
   6. Excise only the epididymal adipose tissue, avoiding damage to the epididymis, testis, and epididymal blood vessels (Figure S1). Soak the excised adipose tissue in the PBS in the Petri dish to prevent dryness and weigh the tissue.
   7. Close the abdominal muscle with 5-0 VICRYL and the skin with a 5-0 nylon suture. Then, return each rat that has undergone surgery to a separate cage (one rat per cage).
      NOTE: Monitor the rats until they fully recover.
2. Isolate rASCs from 2 - 3 g of adipose tissue (excised from a Lewis rat and processed according to a previously-reported method)²⁷. Briefly, enzymatically digest the excised adipose tissue with 0.1% type A collagenase at 37 °C for 1 h to obtain the stromal-vascular fraction (SVF; Figure S2).
   1. Prepare several 100-µm cell strainers, several 50-mL tubes, several 15 mL tubes, and two scalpels on a biological clean bench. Turn on a centrifuge and warm up a water bath to 37 °C. In addition, prepare approximately 50 mL of sterile PBS in a 50 mL tube with 0.1% (final concentration) of type A collagenase.
   2. Mince the adipose tissue into small pieces using two scalpels.
   3. Move all minced adipose tissue to a 50-mL tube and add PBS to bring the total volume to 15 mL.
   4. Rest the 50-mL tube upright for 5 min. Discard the upper layer and collect the lower layer except for the debris.
   5. Add 0.1% of type A collagenase solution to the 50-mL tube with PBS containing the upper layer in order to enzymatically digest the adipose tissue.
      NOTE: Warm approximately 20 mL of PBS per 2 - 3 g of adipose tissue in a 37 °C water bath.
   6. Tilt and shake the 50 mL tube gently at 120 - 130 rpm for 1 h in a 37 °C water bath.
   7. Rest the 50 mL tube upright for 5 min after shaking.
   8. Filter the solution using a 100 µm cell strainer and pour the solution into a new 50 mL tube. Dispense the filtered solution into two 15 mL tubes.
   9. Centrifuge the solution in the 15 mL tubes for 5 min at 700 x g. Carefully remove the upper layer of supernatant and leave 5 mL of the lower layer of the solution. Do not aspirate the pellet.
   10. Add approximately 5 mL of complete culture medium to each 15 mL tube, up to 10 mL per 15 mL tube, and carefully re-suspend the pellet.
   11. Repeat steps 2.2.8 - 2.2.9. Then, obtain the SVF.
3. Prepare two 60 cm² culture dishes. Collect the SVF after two centrifugations at 700 × g for 5 min. Suspend the SVF and plate 10 mL of SVF solution on each 60-cm² culture dish.
4. Culture the dishes for 24 h at 37 °C in a 5% CO₂ incubator.
5. Prepare PBS and 0.25% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), storable for several months at 4 °C until use.
6. After initial plating (24 h), wash the cells with PBS 3 times to remove unattached cells and debris. Add fresh complete medium.
7. Passage the cells that are nearly sub-confluent on day 3. Add 1 mL of 0.25% trypsin-EDTA and incubate the cells at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 3 - 5 min.
   NOTE: Complete the trypsinization step within 10 min to prevent cell damage.
8. Observe the cells under a light microscope after trypsinization to confirm that all the cells have thoroughly detached from the dishes. Then, add 9 mL of complete culture medium to the dishes.
9. Count the number of cells using a hemocytometer.
10. Subculture the cells at a density of 1.7 x 10³ cells/cm² every 3 days until passage 3. Culture the subcultured cells at 37 °C in the humidified atmosphere of a 5% CO₂ incubator.

3. Creation of rASC Sheets

1. Prepare several 35-mm diameter temperature-responsive culture dishes. Pre-coat the dishes with FBS (or complete medium containing FBS) at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for more than 1 h.
   NOTE: A 35 mm diameter temperature-responsive culture dish is a commercially available product.
2. Prepare a thermo-plate and incubate at 37 °C for the following experimental procedures.
   NOTE: Perform every procedure using temperature-responsive culture dishes on a 37 °C thermo-plate to prevent the cells from spontaneously detaching from the dish.
   1. Warm the complete culture medium used in the procedures to 37 °C prior to experimentation.
   2. Seed passage 3 rASCs derived from Lewis rats onto a 35 mm diameter temperature-responsive culture dish at a density of 1.5 x 10⁵ cells/dish for 3 days using a 2 mL total volume of complete culture medium.
      NOTE: When rASCs are plated onto a new culture dish, the dish should be slowly rocked back and forth and left and right in an incubator to achieve uniform rASC seeding and a uniformly thick rASC sheet.
   3. Change 2 mL of the medium to 2 mL of complete culture medium containing 16.4 µg/mL L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (AA) on day 3 after seeding to the temperature-responsive culture dishes incubated on a 37 °C thermo-plate.
      NOTE: Dissolved AA can be stored at -30 °C for months.
   4. Culture the cells for an additional 4 - 5 days and replace the medium every 2 days with fresh medium containing AA.
   5. Confirm the proliferation and generation of ASCs under a light microscope to determine whether gaps occurred between the cells in a contiguous cell sheet.
3. Transfer the cell sheets from the incubator to the benchtop for 15 - 20 min to cool them to room temperature.; observe the cells spontaneously detach as a contiguous cell sheet. Harvest the rASC sheet from the dish surface with a pair of forceps.
   NOTE: Usually, rASC sheets can be handled with a pair of forceps. If necessary, a transfer membrane can be used to transfer a cell sheet from the culture dish to the wound site if the cell sheet is brittle and fragile.

4. Preparation of the Full-thickness Skin Defect Wound Model and Transplantation of rASC Sheets

1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauze, 5-0 nylon suture, a scalpel, a periosteal raspatory, a needle holder, operating scissors, and a pair of forceps. Sterilize the surgical instruments and supplies. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
2. Prepare PBS and maintain it at room temperature, along with some artificial skin and a non-adhesive dressing. Precut the artificial skin (15 x 10 mm) and non-adhesive dressing (20 × 15 mm). Soak the inner collagen sponge layer of the artificial skin in saline before using the artificial skin.
   NOTE: The artificial skin is made of two layers: an outer silicone sheet layer and an inner collagen sponge.
3. Use ZDF rats (16 - 18 weeks old, male, 500 - 600 g) as a wound-healing model for type 2 diabetes and obesity.
4. Anesthetize the ZDF rats by inhalation of 4% isoflurane using a rodent mechanical ventilator. Induce anesthesia by using isoflurane at 4 - 5% via a rodent mechanical ventilator and maintain it at 3 - 4% during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat via a toe pinch.
5. While wearing sterile gloves, position the rat in the prone position on a sterile drape. Clean the head of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol, shave the operative area with an electric razor, and clean the skin after shaving using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
6. Create a squared full-thickness skin defect (15 x 10 mm²) on the head of the anesthetized ZDF rats by removing the cutaneous tissue from the epidermis to the periosteum. Excise the skin and cutaneous tissue with a scalpel and remove the periosteum with a periosteal raspatory.
7. Move the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish from the incubator to a room-temperature environment immediately prior to transplantation.
8. Observe the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish spontaneously detach as a sheet from the dish surface after the formation of a wound. Harvest the rASC sheets after 7 days of culturing on temperature-responsive culture dishes. Remove the cultured medium and wash the rASC sheet with PBS three times. Soak the rASC sheet in PBS until transplantation to prevent desiccation.
9. Place the rASC sheet immediately over the skull defect using a pair of forceps. If the cell sheet is brittle and fragile, a membrane can be used as a scaffold for transferring the cell sheet from the culture dish to the wound site.
10. Cover the rASC sheet and defect with the artificial skin (15 x 10 mm²) and close the wound with approximately 10 stiches using the 5-0 nylon suture. To protect the wound, place a non-adhesive dressing (20 x 15 mm²) over the artificial skin, using 5-0 nylon sutures to keep the wound environment moist and to absorb exudates.
    NOTE: The non-adhesive dressings will be removed by the ZDF rats within a few days after application. Therefore, it is necessary to regularly monitor the rats after transplantation. Usually, the non-adhesive dressing is replaced every 2 days under general anesthesia.
11. Return each rat that has undergone surgery to a separate cage until they have fully recovered (one rat per cage). After an observation period, euthanize the rats using the approved method of isoflurane overdose.

תוצאות

פרוטוקול זה ניסה לבסס טיפול מבוססת תא חדש עבור פצעי סוכרת סורר. בקצרה (כמו מאויר באיור1), גליונות allogeneic rASC שנוצרו חולדות רגילה באמצעות הנדסה תא גיליונות, ואז הושתלו באמצעות bilayer עור מלאכותי על פגם מלא-עובי העור על עכבר סוכרתית. מיקרוסקופ אור תמונות של דוגמה טובה של...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בהצלחה culturing גיליון rASC הן כדלקמן: 1) הטמפרטורה חייבת להישמר כ 37 מעלות צלזיוס במהלך culturing על המנות תרבות מגיבים טמפרטורה. במהלך היצירה של גיליון rASC, כל הליך בוצעה על התרמו-צלחת 37 ° C, ו כל ריאגנט היה התחמם עד 37 ° C כדי למנוע את התאים באופן ספונטני ניתוק מן המנה³¹....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM glutamax	Invitrogen	32571-036	Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS)	Japan Bioserum Co Ltd.	S1650-500
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Collagenase A	Roche Diagnostics	10 103 578 001	Mannheim, Germany
60-cm2 Primaria tissue culture dish	BD Biosciences	353803	Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)	Life Technologies	1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Life Technologies	25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate	Wako	013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)	CellSeed	NUNC-174904	Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000)	Kitazato Science Co., Ltd.	1111
Rodent mechanical ventilator	Stoelting	#50206	Wood Dale, IL
4% isoflurane	Pfizer Japan	114-13340-3	Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®)	Smith & Nephew	PN-R40060	Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®)	Smith & Nephew	66800679	Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture	Alfresa	EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES	greiner bio-one	227 261
15mL Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL	Hu-Friedy	P14	Chicago, IL