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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Fettgewebe Stammzellen (ASC) leicht zu isolieren und aus dem Fett von normalen Ratten geerntet. ASC Blätter können mit Handy-Blatt Engineering erstellt werden und können in Zucker Diabetiker fetthaltige Ratten ausstellenden voll-dicke Haut Mängel mit freiliegenden Knochen und dann bedeckt mit einem Bilayer künstlicher Haut transplantiert werden.

Zusammenfassung

Künstlicher Haut erzielt erhebliche therapeutische Ergebnisse in der klinischen Praxis. Jedoch können künstliche Hautbehandlungen für Wunden bei diabetischen Patienten mit behindert Blutfluss oder große Wunden verlängern. Zellbasierte Therapien erschienen als eine neue Technik für die Behandlung von diabetischen Geschwüren und Zelle-Blatt-Technik verbessert die Wirksamkeit der Zelltransplantation. Eine Reihe von Berichten haben vorgeschlagen, dass Fettgewebe Stammzellen (ASC), eine Art mesenchymaler Stromazellen Zelle (MSC), therapeutisches Potenzial aufgrund ihrer relativen Fülle in Fettgewebe und ihre Zugänglichkeit für die Sammlung im Vergleich zu MSCs aus anderen Geweben zeigen. Daher erscheinen ASC eine gute Quelle für Stammzellen für therapeutische Zwecke. In dieser Studie wurden ASC Blätter aus dem epididymal Fettgewebe Fett von normalen Lewis Ratten mit Temperatur-responsive Kultur Gerichte und normalen Kulturmedium mit Ascorbinsäure erfolgreich erstellt. Die ASC-Blätter wurden in Zucker Diabetes Fettsäuren (ZDF) Ratten verpflanzt, einem Rattenmodell von Typ-2-Diabetes und Adipositas, die verminderte aufweisen Wundheilung. Eine Wunde auf der hinteren kranialen Oberfläche erstellt wurde, ASC Blätter wurden in der Wunde verpflanzt und einem Bilayer Kunsthaut wurde verwendet, um die Blätter zu decken. ZDF-Ratten, die ASC Blätter erhalten hatte besser als ZDF Ratten ohne die Transplantation von ASC Blätter Wundheilung. Dieser Ansatz war begrenzt, da ASC Blätter empfindlich gegen Trockenheit sind, erfordert die Aufrechterhaltung eines feuchten Wundmilieus. Daher wurde Kunsthaut verwendet, um das ASC-Blatt, um Austrocknen zu verhindern, dass zu decken. Die allogene Transplantation von ASC-Blatt in Kombination mit künstlicher Haut könnten auch für andere hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, wie Sie mit peripheren arteriellen Verschlusskrankheit und Kollagen-Krankheit beobachtet und könnte für Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden verabreicht werden. Somit wäre diese Behandlung der erste Schritt zur Verbesserung der therapeutischen Möglichkeiten für Diabetiker, die Wunde heilen.

Einleitung

Die Bevölkerung von Diabetes-Patienten steigt weltweit und 400 Millionen in 20151erreicht; schätzungsweise 15-25 % der Patienten mit Diabetes sind durch das Fortschreiten der unteren Extremität diabetische Geschwüre2gefährdet. Untere Extremität diabetische Geschwüre sind unlösbar und therapeutische längere mit Aufbautraining nach der vollständigen Wiederherstellung erfordern möglicherweise. Periode oft lange Therapie führt zu einem deutlichen Rückgang der Lebensqualität von Patienten. So müssen neue Therapien, die zu verringern oder zu vermeiden Ärger für die Behandlung von diabetischen Wunden entwickelt werden. Um diabetische Wundheilung zu bewerten, haben wir ein diabetisches Geschwür Wundheilung Modell bei Ratten, die praktische klinischen Bedingungen imitiert, optimiert und bewertet ob Umpflanzen Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) Blätter mit Zelle-Blatt Technik beschleunigt die Wundheilung.

Mesenchymale Stromazellen Zellen (MSCs) weisen ein ausgezeichnetes Potenzial zur Beschleunigung der Wundheilung aufgrund ihrer Selbsterneuerung Kapazität, ihre immunmodulatorische Wirkung und ihre Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelle Linien3differenzieren. ASC sind eine Art von MSC abgeleitet aus Fettgewebe, und sie weisen mehrere Vorteile gegenüber MSCs aus anderen Geweben, einschließlich ihrer potenziellen angiogenen und parakrine Aktivität4,5abgeleitet. Fettgewebe ist relativ häufig in den menschlichen Körper und seine Zugänglichkeit ermöglicht Sammlung mit minimal-invasiven Verfahren. Daher wurden ASCs experimentell für Wundheilung Anwendungen6,7verwendet.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass die direkte Einspritzung von einzelligen MSC Suspensionen in Bereiche um Wunden8,9der Wundheilung beschleunigen kann. Trotz Berichte der Beschleunigung der Wundheilung in diabetische Geschwüre Modelle nach der Injektion von einzelligen Suspensionen ist die Überlebenszeit der transplantierten Zellen an der Wundstelle jedoch nicht klar.

In dieser Studie haben wir Zelle-Blatt Engineering mit Temperatur-responsive Kultur Gerichten angewandt. Diese Gerichte haben die Temperatur-responsive Polymer N- Isopropylacrylamide auf ihrer Oberfläche10kovalent gebunden. Die veredelten Polymerschicht ermöglicht temperaturgeführte Zelladhäsion, oder Loslösung von der Oberfläche der Kulturschale. Die Oberfläche der Schale wird bei 37 ° C, so dass Zellen zu halten und vermehren, während Zellen spontan von der Oberfläche zu lösen, wenn sie bei Temperaturen unter 32 ° c hydrophile wird hydrophob Kultivierte Zellen geerntet werden können, als ein zusammenhängender Zelle Blatt mit intakten Zell-Zell-Verbindungen und extrazellulären Matrizen (ECMs) einfach durch Absenken der Temperatur; so sind proteolytische Enzyme, die die ECM wie Trypsin, schädigen nicht erforderlich11. Daher kann Zelle-Blatt Engineering Zell-Zell-Verbindungen erhalten und verbessern die Wirksamkeit der Zelltransplantation.

Darüber hinaus erhöht die Zelle-Blatt Transplantation Zelle Überlebensrate im Vergleich zu Zelle Injektion12. In diesem Protokoll wurden Zucker zuckerkranke fetthaltige (ZDF) Ratten als Typ 2 Diabetes und Adipositas Modell mit verzögerter Wundheilung ausgewählt. ZDF-Ratten entwickeln spontan Übergewicht ca. 4 Wochen. Dann entwickeln sie Typ-2-Diabetes mit Fettleibigkeit zwischen 8 und 12 Wochen alt, an welcher Stelle sie Hyperglykämie Zusammenhang mit Insulin-Resistenz, Dyslipidämie und Hypertriglyceridämie13aufweisen. Verzögerte Wundheilung, verminderte Blutzufuhr in peripheren Blutgefäße und diabetische Nephropathie sind auch14,15,16beobachtet. Darüber hinaus möglicherweise ZDF Ratten ein geeignetes Modell für das Studium, die Heilung von hartnäckigen kutanen Geschwüren, wie z. B. diabetische Geschwüre.

Die Unterschiede zwischen Mensch und Nagetiere in Wundheilung Mechanismen sind anatomische Unterschiede in der Haut zugeordnet. Wundheilung bei normalen Ratten basiert auf Wunde Kontraktion, während Wundheilung beim Menschen auf erneute Epithelisierung und Granulationsgewebe Bildung beruht. In der Regel Wunde Schienung in Nager-Modelle verwendet Wunde Kontraktion zu minimieren und für die allmähliche Bildung von Granulationsgewebe17, obwohl Wunden in nondiabetic Ratten durch Kontraktion fast vollständig geschlossen sind. Doch Diabetiker Wunde Kontraktion im ZDF Ratten beeinträchtigt, und vor allem der Wundheilung erfolgt durch erneute Epithelisierung und Bildung von Granulationsgewebe; Somit ist dieser Prozess ähnlicher menschlichen Wundheilung14.

Diabetische Wunden mit freiliegenden Knochen nach Debridement sind klinisch oft anzutreffen. Frühere Studien haben 12 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken der Athymic nackte Mäuse18,19 und 10 mm Durchmesser voll-dicke Hautwunden auf dem Rücken von normalen Mäusen20untersucht. Um einen klinischen Modell für schwere diabetische Wunden entwickeln, größere (15 x 10 mm2) voll-dicke Hautdefekte mit Knochen ausgesetzt und ohne das Periost erstellt wurden, als zuvor beschriebenen21in Ratten mit Typ-2-Diabetes und Adipositas.

Ratte ASC (rASC) Blätter aus der ASC von normalen Lewis-Ratten wurden durch die allogene Transplantation von ASC Blätter erstellt. In der klinischen Praxis ist autologe Transplantation nicht realisierbar, weil Diabetes-Patienten mit Geschwüren zeigen oft schwere diabetische Komplikationen, wie unkontrollierte hohe Blutzuckerwerte und hohen Body-mass-Indizes und diese Komplikationen Ursache Wundheilung Störungen, die die Schwierigkeit Fettgewebe von diesen Patienten zu erhöhen. Darüber hinaus ASCs von Tieren mit Diabetes Ausstellung Eigenschaften verändert und beeinträchtigt die Funktion22. Deshalb beschreibt das Protokoll hier vorgestellten der allogenen Transplantation rASC Blätter aus normalen Ratten und die Anwendung von künstlicher Haut an diabetischen Ratten.

Die Bilayer künstliche Haut in diesem Protokoll verwendeten verhindert, dass die spontane Kontraktion der Wunden, fördert die Synthese einer neuen Bindegewebe Matrix und ähnelt der wahre Lederhaut23. In diesem Protokoll ist künstlicher Haut auf eine rASC Blatt platziert und mit Nylonfäden zur Verhinderung von Wunde Kontraktion oder Erweiterung aus losen Rattenhaut fixiert. Darüber hinaus die künstliche Haut bietet einen dreidimensionalen Rahmen für die ASC-Blätter, unterhält eine feuchte Umgebung für die transplantierten ASC Bettwäsche und Wunden und schützt die Wunden vor Infektionen und externe Kräfte. Schließlich ist ein nicht klebendes Verband gelegt, über die Wunde vor äußeren Einwirkungen schützen, pflegen ein feuchtes Wundmilieu und Exsudat aufnehmen.

Ein rASC-Blatt ist dünn, flexibel und verformbar und Verschieben von Empfänger Websites, wie z. B. ein schlagendes Herz24eingehalten werden kann. Zelle-Blatt für die Rekonstruktion der verschiedenen Geweben verwendet worden und erzeugen Heilwirkungen25,26. ASC-Blätter, die klinische therapeutisches Potenzial aufweisen könnte beschleunigen die Heilung von vielen Arten von Wunden. Darüber hinaus die allogene Transplantation von ASC Blätter, kombiniert mit dem Einsatz von künstlicher Haut, möglicherweise für die Behandlung von hartnäckigen Geschwüren oder Verbrennungen, z. B. bei der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit oder Kollagen-Krankheit, oder sie können verabreicht werden, um Patienten, die unterernährt sind oder Steroide verwenden. Dieser Ansatz erhöht die Effizienz der Transplantation ASC. Wundheilung ZDF Rattenmodell produziert eine schwere Wunde Erkrankung, die ähnelt die menschlichen Wundheilung und klinische Bedingungen in einem kleinen Versuchstier imitiert.

Protokoll

All experimental protocols presented below were approved by the Animal Welfare Committee of Tokyo Women's Medical University School of Medicine and abided by all requirements of the Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments.

1. Preparation of Animals, Instruments, Culture Media, and Dishes

  1. Prepare complete culture medium using minimum essential medium alpha containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. Store this for several months at 4 °C until use.
  2. Use adult male ZDF rats as a type 2 diabetic obesity model. Use the fat pad of male Lewis rats to isolate adipose tissue to prepare the cell sheets.

2. Isolation and Culture of rASCs

  1. Obtain adipose tissue from Lewis rats (8 - 33 weeks old, male) under general anesthesia using isoflurane.
    1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauzes, a scalpel, a needle holder, operating scissors, a pair of forceps, and a 5-0 nylon suture. Sterilize the surgical instruments and supplies.
    2. Prepare a 100-mm Petri dish with 10 mL of sterile phosphate-buffered saline (PBS) to temporarily preserve the obtained adipose tissue. Weigh the Petri dish with PBS using a balance before starting surgery to measure the collected adipose tissue. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
    3. Anesthetize the rats by using isoflurane at 3 - 4% via a rodent mechanical ventilator and maintain the rats at 2 - 3% isoflurane during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat.
    4. While wearing sterile gloves, position the rat in a supine position on a sterile drape. Shave the operative area with an electric razor and clean the abdominal section of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
    5. Create an approximately 5 cm-long skin incision with a scalpel in the lateral lower abdomen of the rat. Expose and dissect the external oblique muscle. Then, expose the epididymal adipose tissue surrounding the epididymis. Gently pull the epididymal adipose tissue out.
      NOTE: The adipose tissue can be obtained on either side of the rat's abdomen.
    6. Excise only the epididymal adipose tissue, avoiding damage to the epididymis, testis, and epididymal blood vessels (Figure S1). Soak the excised adipose tissue in the PBS in the Petri dish to prevent dryness and weigh the tissue.
    7. Close the abdominal muscle with 5-0 VICRYL and the skin with a 5-0 nylon suture. Then, return each rat that has undergone surgery to a separate cage (one rat per cage).
      NOTE: Monitor the rats until they fully recover.
  2. Isolate rASCs from 2 - 3 g of adipose tissue (excised from a Lewis rat and processed according to a previously-reported method)27. Briefly, enzymatically digest the excised adipose tissue with 0.1% type A collagenase at 37 °C for 1 h to obtain the stromal-vascular fraction (SVF; Figure S2).
    1. Prepare several 100-µm cell strainers, several 50-mL tubes, several 15 mL tubes, and two scalpels on a biological clean bench. Turn on a centrifuge and warm up a water bath to 37 °C. In addition, prepare approximately 50 mL of sterile PBS in a 50 mL tube with 0.1% (final concentration) of type A collagenase.
    2. Mince the adipose tissue into small pieces using two scalpels.
    3. Move all minced adipose tissue to a 50-mL tube and add PBS to bring the total volume to 15 mL.
    4. Rest the 50-mL tube upright for 5 min. Discard the upper layer and collect the lower layer except for the debris.
    5. Add 0.1% of type A collagenase solution to the 50-mL tube with PBS containing the upper layer in order to enzymatically digest the adipose tissue.
      NOTE: Warm approximately 20 mL of PBS per 2 - 3 g of adipose tissue in a 37 °C water bath.
    6. Tilt and shake the 50 mL tube gently at 120 - 130 rpm for 1 h in a 37 °C water bath.
    7. Rest the 50 mL tube upright for 5 min after shaking.
    8. Filter the solution using a 100 µm cell strainer and pour the solution into a new 50 mL tube. Dispense the filtered solution into two 15 mL tubes.
    9. Centrifuge the solution in the 15 mL tubes for 5 min at 700 x g. Carefully remove the upper layer of supernatant and leave 5 mL of the lower layer of the solution. Do not aspirate the pellet.
    10. Add approximately 5 mL of complete culture medium to each 15 mL tube, up to 10 mL per 15 mL tube, and carefully re-suspend the pellet.
    11. Repeat steps 2.2.8 - 2.2.9. Then, obtain the SVF.
  3. Prepare two 60 cm2 culture dishes. Collect the SVF after two centrifugations at 700 × g for 5 min. Suspend the SVF and plate 10 mL of SVF solution on each 60-cm2 culture dish.
  4. Culture the dishes for 24 h at 37 °C in a 5% CO2 incubator.
  5. Prepare PBS and 0.25% trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), storable for several months at 4 °C until use.
  6. After initial plating (24 h), wash the cells with PBS 3 times to remove unattached cells and debris. Add fresh complete medium.
  7. Passage the cells that are nearly sub-confluent on day 3. Add 1 mL of 0.25% trypsin-EDTA and incubate the cells at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 3 - 5 min.
    NOTE: Complete the trypsinization step within 10 min to prevent cell damage.
  8. Observe the cells under a light microscope after trypsinization to confirm that all the cells have thoroughly detached from the dishes. Then, add 9 mL of complete culture medium to the dishes.
  9. Count the number of cells using a hemocytometer.
  10. Subculture the cells at a density of 1.7 x 103 cells/cm2 every 3 days until passage 3. Culture the subcultured cells at 37 °C in the humidified atmosphere of a 5% CO2 incubator.

3. Creation of rASC Sheets

  1. Prepare several 35-mm diameter temperature-responsive culture dishes. Pre-coat the dishes with FBS (or complete medium containing FBS) at 37 °C in a 5% CO2 incubator for more than 1 h.
    NOTE: A 35 mm diameter temperature-responsive culture dish is a commercially available product.
  2. Prepare a thermo-plate and incubate at 37 °C for the following experimental procedures.
    NOTE: Perform every procedure using temperature-responsive culture dishes on a 37 °C thermo-plate to prevent the cells from spontaneously detaching from the dish.
    1. Warm the complete culture medium used in the procedures to 37 °C prior to experimentation.
    2. Seed passage 3 rASCs derived from Lewis rats onto a 35 mm diameter temperature-responsive culture dish at a density of 1.5 x 105 cells/dish for 3 days using a 2 mL total volume of complete culture medium.
      NOTE: When rASCs are plated onto a new culture dish, the dish should be slowly rocked back and forth and left and right in an incubator to achieve uniform rASC seeding and a uniformly thick rASC sheet.
    3. Change 2 mL of the medium to 2 mL of complete culture medium containing 16.4 µg/mL L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (AA) on day 3 after seeding to the temperature-responsive culture dishes incubated on a 37 °C thermo-plate.
      NOTE: Dissolved AA can be stored at -30 °C for months.
    4. Culture the cells for an additional 4 - 5 days and replace the medium every 2 days with fresh medium containing AA.
    5. Confirm the proliferation and generation of ASCs under a light microscope to determine whether gaps occurred between the cells in a contiguous cell sheet.
  3. Transfer the cell sheets from the incubator to the benchtop for 15 - 20 min to cool them to room temperature.; observe the cells spontaneously detach as a contiguous cell sheet. Harvest the rASC sheet from the dish surface with a pair of forceps.
    NOTE: Usually, rASC sheets can be handled with a pair of forceps. If necessary, a transfer membrane can be used to transfer a cell sheet from the culture dish to the wound site if the cell sheet is brittle and fragile.

4. Preparation of the Full-thickness Skin Defect Wound Model and Transplantation of rASC Sheets

  1. Prepare a rodent mechanical ventilator and 4% isoflurane. Prepare several sterile cotton tips, clean gauze, 5-0 nylon suture, a scalpel, a periosteal raspatory, a needle holder, operating scissors, and a pair of forceps. Sterilize the surgical instruments and supplies. Lay out the surgical instruments and supplies on a sterile drape.
  2. Prepare PBS and maintain it at room temperature, along with some artificial skin and a non-adhesive dressing. Precut the artificial skin (15 x 10 mm) and non-adhesive dressing (20 × 15 mm). Soak the inner collagen sponge layer of the artificial skin in saline before using the artificial skin.
    NOTE: The artificial skin is made of two layers: an outer silicone sheet layer and an inner collagen sponge.
  3. Use ZDF rats (16 - 18 weeks old, male, 500 - 600 g) as a wound-healing model for type 2 diabetes and obesity.
  4. Anesthetize the ZDF rats by inhalation of 4% isoflurane using a rodent mechanical ventilator. Induce anesthesia by using isoflurane at 4 - 5% via a rodent mechanical ventilator and maintain it at 3 - 4% during surgery. Monitor the depth of anesthesia by observing the depth and rate of respiration of each rat via a toe pinch.
  5. While wearing sterile gloves, position the rat in the prone position on a sterile drape. Clean the head of the rat using sterile gauze soaked in 70% ethanol, shave the operative area with an electric razor, and clean the skin after shaving using sterile gauze soaked in 70% ethanol.
  6. Create a squared full-thickness skin defect (15 x 10 mm2) on the head of the anesthetized ZDF rats by removing the cutaneous tissue from the epidermis to the periosteum. Excise the skin and cutaneous tissue with a scalpel and remove the periosteum with a periosteal raspatory.
  7. Move the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish from the incubator to a room-temperature environment immediately prior to transplantation.
  8. Observe the rASCs on the 35 mm temperature-responsive culture dish spontaneously detach as a sheet from the dish surface after the formation of a wound. Harvest the rASC sheets after 7 days of culturing on temperature-responsive culture dishes. Remove the cultured medium and wash the rASC sheet with PBS three times. Soak the rASC sheet in PBS until transplantation to prevent desiccation.
  9. Place the rASC sheet immediately over the skull defect using a pair of forceps. If the cell sheet is brittle and fragile, a membrane can be used as a scaffold for transferring the cell sheet from the culture dish to the wound site.
  10. Cover the rASC sheet and defect with the artificial skin (15 x 10 mm2) and close the wound with approximately 10 stiches using the 5-0 nylon suture. To protect the wound, place a non-adhesive dressing (20 x 15 mm2) over the artificial skin, using 5-0 nylon sutures to keep the wound environment moist and to absorb exudates.
    NOTE: The non-adhesive dressings will be removed by the ZDF rats within a few days after application. Therefore, it is necessary to regularly monitor the rats after transplantation. Usually, the non-adhesive dressing is replaced every 2 days under general anesthesia.
  11. Return each rat that has undergone surgery to a separate cage until they have fully recovered (one rat per cage). After an observation period, euthanize the rats using the approved method of isoflurane overdose.

Ergebnisse

Dieses Protokoll versucht, eine neue zellbasierte Therapie bei hartnäckigen diabetische Wunden herzustellen. Kurz (wie in Abbildung 1dargestellt), allogene rASC Blätter entstanden aus normalen Ratten mit Zelle-Blatt Engineering und wurden dann mit einem Bilayer künstlicher Haut auf eine voll-dicke Hautdefekt auf einer diabetischen Ratten verpflanzt. Lichtmikroskop Bilder ein gutes Beispiel für eine rASC Blatt (Abbildung 2A) und ein schlechtes Beispiel...

Diskussion

Die kritischsten Schritte für das züchten erfolgreich eine rASC Blatt sind wie folgt: 1) die Temperatur bei etwa 37 ° C während der Kultivierung auf Temperatur reagierende Kultur Gerichte beibehalten werden. Während der Erstellung eines Blattes rASC jedes Verfahren durchgeführt wurde, auf einem 37 ° C Thermo-Teller und jedes Reagenz wurde auf 37 ° C zu verhindern, dass Zellen spontan aus der Schale31abnehmen gewärmt. (2) die Empfänger ZDF Ratten müssen überwacht werden, um die Entfernu...

Offenlegungen

Folgenden Autoren offenlegen finanzielle Beziehungen zu dieser Publikation: Teruo Okano ist Gründer und Direktor des Board of Cell Samen Inc., das Technik und Patente medizinische Universität Tokio Damen lizenziert, und Teruo Okano und Masayuki Yamato sind Akteure in Zelle Samen Inc. Tokyo Medical Frauenuniversität erhält Forschungsgelder aus Zelle Seed Inc. Die anderen Autoren erklären, dass sie keinen finanzielle Beziehungen relevant für diese Publikation.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Yukiko Koga der Abteilung für plastische und Rekonstruktionschirurgie, Juntendo University School of Medicine, für die praktische Beratung. Wir danken auch Herrn Hidekazu Murata der diabetischen Center of Tokyo Women Medical University School of Medicine für ausgezeichneten technischen Support. Diese Studie wurde unterstützt durch die Schaffung von Innovationszentren für erweiterte interdisziplinäre Bereiche Forschungsprogramm des Projekts für Entwicklungsländer Innovationssysteme "Zelle Blatt Tissue Engineering Center (CSTEC)" vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penicillin/streptomycinLife Technologies15140-122
Collagenase ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Germany
60-cm2 Primaria tissue culture dishBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS)Life Technologies1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Life Technologies25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrateWako013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd.1111
Rodent mechanical ventilatorStoelting#50206Wood Dale, IL
4% isofluranePfizer Japan114-13340-3Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®)Smith & NephewPN-R40060 Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®)Smith & Nephew66800679Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon sutureAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBESgreiner bio-one227 261
15mL Centrifuge TubeCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Referenzen

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