الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

أثبتت التطورات الأخيرة من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) أن الخلايا الجسمية الناضجة يمكن ان يعود الى وجود دولة المحفزة غير متمايزة. الآن، ويتم إعادة برمجة مع أنواع مختلفة من الخلايا الجسدية للبالغين: الكيراتينية والخلايا البول، والخلايا الليفية، الخ وعادة ما فعلت التجارب المبكرة مع الخلايا الليفية الجلدية. ومع ذلك، وهذا يتطلب إجراء العمليات الجراحية الغازية للحصول على الخلايا الليفية من المرضى. لذلك، فإن الخلايا تعليق، مثل خلايا الدم والبول، واعتبرت مثالية لإعادة البرمجة وذلك بسبب سهولة الحصول على الخلايا الأولية. هنا، ونحن التقرير بروتوكول كفاءة لتوليد IPSC من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs). بواسطة الطلاء وPBMCs transduced متسلسل ل، لوحة باستخدام الطرد المركزي الجديدة المغلفة المصفوفة، يمكن هذا البروتوكول بسهولة توفير المستعمرات التوجيهية. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على خلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs). وتقدم هذه الدراسة بروت بسيطة وفعالةocol لإعادة برمجة PBMCs وCBMCs.

Introduction

وكانت الخلايا الجذعية واحدة من المواد الأكثر جاذبية في العلاج السريري لمشاركة عدة عقود ^1. خصائص جذابة للخلايا الجذعية تعدد القدرات والقدرة على تجديد الذات. في عام 1981، تم عزل أول الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) من جنين فأر ^2. ومع ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لأجنة بشرية، واجهت العديد من القضايا الأخلاقية.

في عام 2006، عندما برمجة الدكتور ياماناكا وفريقه أول خلية المحفزة من الخلايا الجسدية الماوس، استعاد مجال الخلايا الجذعية إمكانية ووانتعشت الفائدة ^3. من خلال تقديم العديد من العوامل المحددة، وكانت الخلايا الجذعية المحفزة بنجاح "التي يسببها" من الخلايا الجسدية للبالغين، ووهكذا اسمه "الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)." في عام 2007، تم تطبيق هذا الأسلوب على الخلايا البشرية ^4، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على الخصائص الدقيقة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية ولكن أيا من النقاش الأخلاقي. من الناحية النظرية، الجذعخدمات العملاء يمكن أن تتولد من أي نوع من الخلايا التي تم الحصول عليها من أي فرد أو المريض. iPSCs-مريض معين ترتفع كأداة المحتملة التي يمكن محاكاة الظواهر المرض والظروف جينية من كل مريض على حدة. عن طريق تحرير الجينات أو غيرها من الوسائل التي يمكن عكس حالة المسببة للأمراض، iPSCs المريض محددة يمكن أيضا أن تستخدم في الطب الشخصية ^5. وعلاوة على ذلك، فإن أقل المرتبطة iPSCs مع الرفض المناعي لأن لديهم نفس الهوية المناعية مثل المانحة، مما يجعل لصناعة السيارات في زرع أكثر جدوى ^6. وبالتالي، أصبحت iPSCs منصة الواعدة في مجال النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاجات التجدد. ونظرا لهذه الفوائد، وتحسين البروتوكولات التي يمكن أن تعطي أنقى وزيادة الغلة في أقل قدر من الوقت من مصدر خلية أصغر هي دائما تحت التطوير. أحد الاعتبارات الرئيسية في العثور على البروتوكول الأكثر كفاءة لتطبيقها في المستقبل هو نوع من الخلايا الأولية. معظم أوائل IPSC الجيل بروتوهي الأمثل العواميد لخلايا ملتصقة منذ خطوط التوجيهية الأصلية استميلت من الخلايا الليفية الجلد ^4. ومع ذلك، فإن العزلة وإعداد هذه الخلايا هي كثيفة العمالة. أيضا، وعزل الخلايا الليفية الجلد وتشمل العمليات الجراحية الغازية التي يمكن أن تصبح أحد أوجه القصور الرئيسية لتطبيقها على نطاق أوسع.

لذلك، لاستخدام المزيد من iPSCs، لا بد من مصدر الخلية مع اكتساب مريحة. ويعتبر الدم كمصدر للخلايا المثالي منذ تم الحصول عليها من خلال إجراء بدلا مينيملي ^7-9. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير تعديل بسيط لتوليد hiPSCs من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) البروتوكول. دون عملية التوسع صعبة من نوع خلية معينة، مثل الخلايا CD34 +، وخلايا الدم الكامل أو PBMCs كانت مطلية بشكل متسلسل على لوحات المغلفة مصفوفة بواسطة الطرد المركزي بعد تنبيغ مع فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا. خفضت هذه الطريقة الوقت اللازم لمرفق من الخلايا العائمة transduced وانخفض فقدان الخلايا المعاد برمجتها التي لم تكن قادرة على تولي بمفردهم.

Protocol

بيان الأخلاق: وافق هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC12TISI0861).

1. عزل خلايا الوحيدات من الدم

1. عزل خلايا الوحيدات (يوم -5)
   1. الحصول على ما لا يقل عن 10 مل من الدم النقي من سحب الدم في أنبوب إعداد الخلية (CPT).
   2. نقل الدم إلى أنبوب جديد مخروطي 50 مل وتمييع مع معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في نسبة 1: 4.
      ملاحظة: نسبة أعلى من تخفيف يمكن استخدامها لأعلى نقاء.
   3. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام كثافة التدرج إلى أنبوب مخروطي 50 مل الجديد وطبقة بعناية الدم المخفف على رأس وسائل الإعلام التدرج الكثافة. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) بدون فرامل الطرد المركزي.
   4. نقل بعناية الطبقة الشهباء إلى أنبوب مخروطي 50 مل الجديد، إضافة 30 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب، وغسل الخلايا.
   5. الطرد المركزي الخلايا في 515 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
   6. تجاهل برنامج تلفزيوني و resuspend الخلايا في 0.5 مل من وسائل الاعلام خلايا الدم.
   7. عد الخلايا ولوحة 1 × 10 ⁶ خلايا لكل بئر من 24 لوحة جيدا. إضافة إلى برنامج تلفزيوني الآبار المحيطة بها لمنع التبخر.
   8. استقرار الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ قبل تنبيغ. إضافة 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام خلية دماء جديدة في الأيام 3-4 من دون إزعاج الخلايا.

2. تنبيغ من سينداي الفيروسات

1. تنبيغ (يوم 0)
   1. جمع ونقل خلايا الدم إلى أنبوب مخروطي 15 مل ونعدهم باستخدام عدادة الكريات.
   2. إعداد 3 × 10 ⁵ خلايا لكل التنبيغ وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 515 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
   3. تجاهل طاف بواسطة الشفط وresuspend الخلايا في 0.5 مل من وسائل الاعلام خلايا الدم.
   4. نقل الخلايا إلى بئر من لوحة غير المغلفة 24-جيدا.
   5. ذوبان الجليد الخليط سينداي الفيروس في الجليد وإضافته إلى سوخلايا سبينديد. إضافة فيروس سينداي الى الخلايا بناء على توصيات الشركة الصانعة.
   6. ختم لوحة مع فيلم الختم وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1150 x ج لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية.
   7. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في CO ₂ بين عشية وضحاها (O / N) 5٪.
2. نقل الخلية إلى مصفوفة المغذية (يوم 1)
   1. في اليوم التالي، ومعطف 24 لوحة جيدا مع vitronectin. تمييع الحل vitronectin في برنامج تلفزيوني لتركيز / مل النهائي 5 ميكروغرام. إضافة 1 مل من vitronectin إلى بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان ذلك في RT لا يقل عن 1 ساعة. إزالة طلاء الحل قبل الاستخدام. لوحات مغلفة يمكن تخزينها في RT لمدة 3 أيام.
   2. نقل عن وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا والفيروس إلى المغلفة جيدا.
   3. جمع الخلايا المتبقية مع 0.5 مل إضافية من وسائل الإعلام خلية دماء جديدة وإضافتها إلى الخلية التي تحتوي أيضا.
   4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1150 x ج لمدة 10 دقيقة في 35 درجة مئوية.
   5. بعد المائةrifugation، وإزالة طاف، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام التوجيهية، والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ O / N.
3. نقل الخلية الثانية (يوم 2)
   1. معطف الآبار من 24 لوحة جيدا جديدة مع 5 ميكروغرام / مل vitronectin، كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. استخدام بئر واحدة من لوحة لكل ترنسدوكأيشن.
   2. نقل تعليق خلية من اللوحة الأولى إلى لوحة vitronectin المغلفة حديثا.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك حاجة، يمكن التخلص منها خلايا تعليق. الإجراء المنصوص عليه في الخطوة 2.3 يمكن أن تتكرر 2-3 مرات مع الخلايا تعليق. إذا سوف تتكرر الخطوات، حصاد الخلايا.
   3. وفي الوقت نفسه، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام التوجيهية للبئر من لوحة الأولى، لصيانة، واحتضان ذلك عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ O / N.
   4. الحفاظ على خلايا تعلق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ وإجراء تغيير وسائل الاعلام اليومي مع وسائل الاعلام التوجيهية جديدة. سوف تظهر المستعمرات في أيام 14-21 بعد تنبيغ.
   5. Centrifugالبريد لوحة مطلية حديثا تحتوي على خلايا تعليق في 1150 x ج و 35 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   6. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ O / N.
   7. في اليوم التالي، وإزالة طاف واستبدالها مع وسائل الاعلام التوجيهية جديدة.
      ملاحظة: الإجراء المذكور في الخطوة 2.3 يمكن أن تتكرر 2-3 مرات مع الخلايا تعليق. إذا سوف تتكرر الخطوات، حصاد الخلايا في طاف وكرر الخطوة 2.3.
   8. الحفاظ على خلايا المرفقة مع التغييرات وسائل الإعلام اليومية حتى يتم التوصل إلى 80٪ confluency.

3. إعادة برمجة الصيانة خلية

1. صيانة مبكرة بعد ثقافة 24 لوحة جيدا
   1. بعد 7-10 أيام تنبيغ، وبمجرد أن الخلايا هي متكدسة، وإعداد، طبق vitronectin المغلفة من عيار 60 ملم. تمييع الحل vitronectin في برنامج تلفزيوني لتركيز / مل النهائي 5 ميكروغرام. إضافة 1 مل من vitronectin إلى الطبق واحتضان ذلك في RT لا يقل عن 1 ساعة.
   2. غسلالخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا.
   3. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 2 دقيقة.
   4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 3 مل من وسائل الاعلام التوجيهية جديدة.
   5. لوحة كل الخلايا معلق على المغلفة حديثا طبق من عيار 60 ملم.
   6. إضافة 10 ملي RHO كيناز إلى الخلايا والمحافظة عليها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ حتى الخلايا هي 80٪ متموجة.
2. انقسام لظهور مستعمرة (إعداد استنساخ فرعي)
   1. إعداد، طبق المغلفة vitronectin 100 ملم، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
   2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا.
   3. احتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 2 دقيقة.
   4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة.
   5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعداد 1 × 10 ⁴ خلايا في طبق.
   6. الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج و RT لمدة 2 دقيقة.
   7. و resuspend 1 × 10 ⁴ الخلايا في 6 مل من وسائل الاعلام التوجيهية، لوحة لهم على طبق المغلفة 100 ملم، وإضافة 10 ملي RHO كيناز إلى وسائل الإعلام.
   8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة أسبوع حتى تظهر مستعمرات كبيرة.
      ملاحظة: صيانة وتوسيع المستعمرات لاستنساخ فرعي. استنساخ فرعي وعادة ما يتم في أقل من 5 فقرات.
3. مستعمرة اختيار باستخدام مستعمرة IPSC فصل الحل
   1. وقبل أسبوع من قطف مستعمرة، والبذور 1 × 10 ⁴ خلايا في، طبق المغلفة vitronectin 100 ملم، كما ذكر في الخطوة 3.2.7.
   2. إعداد، طبق المغلفة vitronectin 60 ملم وذلك بإضافة 2 مل من محلول vitronectin وتفرخ على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
   3. من خلال مراقبة من خلال المجهر (40X أو 100X التكبير)، بمناسبة المستعمرات مع حدود واضحة باستخدام قلم علامة. إزالة حل vitronectin من لوحة جديدة في الخطوة 3.3.2 وإضافة 6 ملمن IPSC وسائل الإعلام تستكمل مع 10 ملي RHO كيناز.
   4. إزالة مستنبت من خلايا وغسلها مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
   5. إضافة 1 مل من مستعمرة IPSC حل فصل واحتضان لهم لمدة 30 ثانية في RT.
   6. إزالة الحل من لوحة واحتضان ذلك على RT لمدة 30 ثانية إضافية.
   7. باستخدام ماصة P200، رسم 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام من لوحة وفصل المستعمرات المستهدفة من قبل pipetting. نقل المستعمرات المنتشرة على طبق جديد 100 ملم.
   8. احتضان والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
      ملاحظة: بعد الحصول على مستعمرة IPSC نقية، تمت المحافظة على الخلايا حتى وصلوا إلى مرور وقد تم 10. توصيف بعد لا يقل عن 10 الممرات. وترد التخفيفات الأجسام المضادة والمعلومات التمهيدي في الجدولين 1 و 2.

النتائج

ويعرض هذا البروتوكول طريقة بسيطة لإعادة برمجة PBMCs معزولة من الدم. باستخدام مزيج من الطلاء المسلسل والطرد المركزي، تم إنشاؤها iPSCs بنجاح. مع هذا الأسلوب، يمكن أن تتولد iPSCs مع كمية صغيرة من خلايا الدم كاملة دون عزل أو توسيع نوع خلية معينة. ولدت لنا بنجاح ...

Discussion

منذ الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) وأظهرت العديد من أوجه القصور، ويتطلب ضرورة وجود أداة بديلة. لذلك، جاءت تطور الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من خلال ياماناكا تحت الاضواء الدولية. وكان ما يقرب من عقد من الزمان منذ اكتشف ياماناكا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer