נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

Summary

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

ההתפתחות האחרונה של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) הוכיחה כי תאי סומטיים בוגרים יכולים לחזור למצב מובחן, פלוריפוטנטיים. עכשיו, תכנות מחדש נעשה עם סוגים שונים של תאי סומטיים מבוגרים: קרטינוציטים, תאים שתן, פיברובלסטים, וכו ניסויים מוקדמים בדרך כלל נעשו עם פיברובלסטים עורי. עם זאת, זה נדרש הליך כירורגי פולשני להשיג פיברובלסטים מן המטופלים. לכן, תאי השעיה, כגון תאי דם ושתן, נחשבו אידיאליים עבור תכנות מחדש בגלל הנוחות של קבלת התאים הראשוניים. כאן אנו מדווחים פרוטוקול יעיל עבור הדור iPSC מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). על ידי ציפוי PBMCs transduced סדר צנטריפוגה באמצעות צלחת חדשה, מצופה-מטריקס, פרוטוקול זה יכול בקלות לספק מושבות iPSC. שיטה זו היא גם החלימה על תאי mononuclear דם חבל טבור (CBMCs). מחקר זה מציג prot פשוטה ויעילהocol עבור תכנות מחדש של PBMCs ו CBMCs.

Introduction

תאי גזע היו אחד החומרים הכי האטרקטיביים בטיפול קליני עבור ¹ העשורים האחרונים. המאפיינים האטרקטיביים של תאי גזע הם pluripotency והיכולת עצמי לחדש. בשנת 1981, את תאי הגזע העובריים הראשון (ESCs) נותקו מן העובר העכבר ^2. עם זאת, כאשר הטכניקה יושמה כדי עוברי אדם, היא נתקלה בכמה סוגיות אתיות.

בשנת 2006, כאשר ד"ר יאמאנאקה וצוותו לתכנות מחדש תא פלוריפוטנטיים הראשון מן תאי הסומטיים עכבר, בתחום תאי גזע שהעלה האפשרות שלה וריבית התעוררה מחדש ^3. ידי אספקת מספר גורמים מוגדרים, תאי גזע פלוריפוטנטיים היו בהצלחה "מושרים" מן התאים הסומטיים מבוגרים, ובכך נקראו "תאי גזע מושרים (iPSCs)." בשנת 2007, טכניקה זו יושמה תאים אנושיים ^4, מניב תאים עם המאפיינים המדויקים של ESCs אבל אף אחד הדיון האתי. באופן תיאורטי, שב"סCs ניתן להפיק מכל סוג תא המתקבל כל יחיד או מטופל. חולה ספציפי iPSCs עולה ככלי פוטנציאלי שיכול לדמות את פנוטיפים המחלה ותנאי אפיגנטיים של כל מטופל ומטופל. באמצעות עריכת גן או שיטות אחרות שיכול להפוך את המצב פתוגניים, iPSCs מטופל ספציפי יכול לשמש גם ברפואה אישית ^5. יתר על כן, iPSCs הם פחות קשור דחייה חיסונית כי יש להם את אותה זהות חיסונית כמו התורם, קבלת השתלה אוטומטית ריאלית יותר ^6. לכן, iPSCs הפך הפלטפורמה המבטיחה ביותר דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולים רגנרטיבית. בהתחשב היתרונות הללו, פרוטוקולי שיפור שיכול לתת טהור ותשואות גבוהות יותר, בזמן הקצר ביותר ממקור התא הקטן הם כל זמן בפיתוח. שיקול מרכזי אחד למצוא את הפרוטוקול היעיל ביותר עבור יישום עתידי הוא סוג התא הראשוני. רוב פרוטו הדור iPSC מוקדםעמודות מותאמות עבור תאים חסידים מאז קווי iPSC המקוריים היו מושרה מן fibroblasts עור ^4. עם זאת, בידוד והכנת תאים אלה הם עבודה אינטנסיבית. כמו כן, את הבידוד של פיברובלסטים עור כולל ניתוחים פולשניים שיכול להפוך חסרון גדול עבור יישום רחב יותר.

לכן, עבור המשך שימוש iPSCs, מקור תא עם רכישה נוחה נדרש. דם נחשב כמקור תא אידיאלי שכן הוא מתקבל באמצעות הליך די פולשנית ^7-9. במחקר זה, פיתחנו שינוי פשוט לפרוטוקול יצירת hiPSCs מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). בהעדר תהליך ההתרחבות הקשה של סוג תא מסוים, כגון CD34 + תאים, תאי דם מלאים או PBMCs היו מצופה סדרתי לצלחות מצופת מטריצה ​​על ידי צנטריפוגה לאחר התמרתי עם וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה. שיטה זו הקטינה את הזמן הדרושמצורף של תאים צפים transduced וירידה בהפסד של תאים לתכנות מחדש כי לא היו מסוגלים לצרף בכוחות עצמם.

Protocol

משפט ואתיקה: זה פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861).

1. ניתוק של תאי monocytic מדם

1. בידוד של תאים monocytic (יום -5)
   1. להשיג לפחות 10 מ"ל של דם טרי מן בתיקו דם בתוך שפופרת הכנת התא (CPT).
   2. מעבירים את הדם אל צינור חרוטי 50 מ"ל חדשים לדלל אותו עם בופר פוספט סטרילית (PBS) ביחס של 1: יחס 4.
      הערה: יחס גבוה יותר של דילול יכול לשמש טוהר גבוה.
   3. הוסף 10 מ"ל של התקשורת שיפוע צפיפות צינור חרוטי 50 מ"ל חדש ובזהירות שכבת הדם מדולל על גבי מדיה שיפוע צפיפות. צנטריפוגה ב 750 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הבלם צנטריפוגה.
   4. להעביר בזהירות את השכבה באפי צינור חרוטי 50 מ"ל חדש, להוסיף 30 מ"ל של PBS על הצינור, לשטוף את התאים.
   5. צנטריפוגה התאים ב 515 XG במשך 5 דקות ב RT.
   6. בטל PBS ו resuspend התאים 0.5 מ"ל של התקשורת תא דם.
   7. ספירת תאי צלחת 1 x 10 ⁶ תאים לכל גם צלחת 24 באר. להוסיף PBS על הבארות סביב על מנת למנוע אידוי.
   8. לייצב את התאים למשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ לפני התמרה. הוסף 0.5 מיליליטר נוסף של תקשורת תא דם הטריה בימים 3-4 מבלי להפריע את התאים.

2. התמרה על ידי Virus סנדאי

1. תמרה (יום 0)
   1. אסוף ולהעביר את תאי הדם אל צינור חרוטי 15 מ"ל ולספור אותם באמצעות hemocytometer.
   2. כן 3 x 10 ⁵ תאים לכל תמרת צנטריפוגות התאים ב 515 XG במשך 5 דקות ב RT.
   3. בטל supernatant ידי יניקה resuspend התאים 0.5 מ"ל של התקשורת תא דם.
   4. מעבירים את התאים גם צלחת 24 גם שאינו מצופה.
   5. להפשיר את תערובת הווירוס סנדאי בקרח ולהוסיף אותו אל suתאי spended. להוסיף וירוס סנדאי אל התאים בהתבסס על המלצות היצרן.
   6. חותם את הצלחת עם סרט איטום צנטריפוגות אותו 1,150 XG במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס.
   7. לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך הלילה (O / N).
2. תא העברה מטריקס מזין (יום 1)
   1. למחרת, מעיל צלחת 24 גם עם vitronectin. לדלל את פתרון vitronectin ב PBS ריכוז 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי. הוסף 1 מ"ל של vitronectin אל באר צלחת 24-היטב דגירה זה ב RT לפחות שעה 1. הסר את פתרון הציפוי לפני השימוש. ניתן לאחסן צלחות מצופות ב RT במשך 3 ימים.
   2. להעביר את כל התקשורת המכילה את התאים ואת הנגיף המצופה היטב.
   3. אוסף את התאים הנותרים עם 0.5 מיליליטר נוסף של תקשורת תא דם הטריה ולהוסיף אותו לתא המכיל גם.
   4. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,150 XG במשך 10 דקות ב 35 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר אגורהrifugation, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת iPSC, ולתחזק את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ O / N.
3. תא העברה שנית (יום 2)
   1. מעיל הבארות של צלחת 24 באר חדשה עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​vitronectin, כמתואר בשלב 2.2.1. השתמש גם אחד של הצלחת לכל תמרה.
   2. מעבירים את ההשעיה תא מהצלחת הראשונה לצלחת vitronectin מצופה החדש.
      הערה: אם אין צורך, תאי השעיה יכולים להיות מושלכים. ההליך הנזכר בשלב 2.3 ניתן לחזור 2-3 פעמים עם תאי ההשעיה. אם הצעדים יחזור על עצמו, לקצור את התאים.
   3. בינתיים, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת iPSC אל הבאר של הצלחת הראשונה, לצורך תחזוקה, דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ O / N.
   4. לשמור על התאים מחוברים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולבצע שינוי תקשורת יומי עם תקשורת iPSC טריה. מושבות תופענה בימים 14-21 לאחר תמרה.
   5. Centrifugדואר צלחת המצופה החדש המכילה את תאי השעיה על 1,150 XG ו -35 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   6. לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ O / N.
   7. למחרת, להסיר את supernatant ולהחליפה תקשורת iPSC טריה.
      הערה: ההליך הנזכר בשלב 2.3 ניתן לחזור 2-3 פעמים עם תאי ההשעיה. אם הצעדים יחזור על עצמו, למסוק את התאים supernatant וחזור על שלב 2.3.
   8. לשמור על תאים המצורפים עם שינויי תקשורת מדי יום עד 80% confluency הוא הגיע.

3. תחזוקה ניידת לתכנות מחדש

1. תחזוקה מוקדם לאחר בתרבות צלחת 24 גם
   1. 7-10 ימים לאחר התמרה, פעם התאים הם ומחובר, להכין מצופה-vitronectin, 60 מ"מ צלחת. לדלל פתרון vitronectin ב PBS ריכוז 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי. הוסף 1 מ"ל של vitronectin כדי בצלחת דגירה אותו ב RT לפחות שעה 1.
   2. שטפו אתתאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של PBS / 1 mM EDTA כדי לנתק את התאים.
   3. דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 2 דקות.
   4. קציר התאים צנטריפוגות אותם ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 3 מיליליטר של תקשורת iPSC הטריה.
   5. פלייט כל התאים resuspended על צלחת 60 מ"מ מצופה החדש.
   6. הוסף 10 מעכב קינאז מ"מ RHO לתאי ולשמור אותם על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ עד התאים הם 80% ומחוברות.
2. פיצול עבור מראה מושבה (עריכת subcloning)
   1. כן מצופה vitronectin, 100 מ"מ צלחת, כמתואר בשלב 3.1.2.
   2. שוטפים את התאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של EDTA מ"מ PBS / 1 עד לנתק את התאים.
   3. דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 2 דקות.
   4. קציר התאים צנטריפוגות אותם ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות.
   5. ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולהכין 1 x 10 ⁴ תאים לכל צלחת.
   6. צנטריפוגה התאים ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות.
   7. גלולה 1 x 10 ⁴ תאים 6 מ"ל של התקשורת iPSC, צלחת אותם על צלחת 100 מ"מ מצופה, ולהוסיף 10 מעכב קינאז מ"מ RHO לתקשורת.
   8. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשך שבוע עד מופיעות מושבות גדולות.
      הערה: לשמור ולהרחיב את המושבות עבור subcloning. Subcloning נעשה בדרך כלל מתחת לגיל 5 קטעים.
3. המושבה לקטוף באמצעות המושבה iPSC ניתוק פתרון
   1. שבוע לפני קטיף מושבה, זרעים 1 x 10 ⁴ תאים מצופים vitronectin, 100 מ"מ צלחת, כאמור בשלב 3.2.7.
   2. כן מצופה vitronectin, 60 מ"מ צלחת על ידי הוספת 2 מיליליטר של תמיסת vitronectin ו דוגרים על RT במשך לפחות 1 שעה.
   3. על ידי התבוננות דרך מיקרוסקופ (40X או הגדלה 100X), לסמן מושבות עם גבולות ברורים באמצעות עט סימון. הסר את פתרון vitronectin מהצלחת החדשה שנעשתה בשלב 3.3.2 ולהוסיף 6 מיליליטרהתקשורת של iPSC בתוספת 10 קינאז מ"מ RHO.
   4. הסר בינוני תרבות מן התאים ולשטוף אותם עם 3 מ"ל של PBS.
   5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק המושבה iPSC דגירה אותם למשך 30 שניות ב RT.
   6. הסר את הפתרון מהצלחת דגירה זה ב RT למשך 30 שניות נוספות.
   7. בעזרת פיפטה P200, לצייר 200 μl של תקשורת מהצלחת ולנתק את המושבות הממוקדות על ידי pipetting. מעביר את המושבות המפוזרות על צלחת 100 מ"מימ החדשים.
   8. דגירה ולתחזק את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
      הערה: לאחר קבלת מושבת iPSC טהורה, תאים היו מתוחזקים עד שהגיעו מעבר 10. אפיון נעשה לאחר 10 קטעים לפחות. דילולים נוגדן ומידע פריימר מוצגים בלוחות 1 ו -2.

תוצאות

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה לתכנת מחדש PBMCs מבודד מדם. באמצעות השילוב של ציפוי צנטריפוגה סדר, iPSCs נוצר בהצלחה. באמצעות שיטה זו, iPSCs יכול להיווצר עם כמות קטנה של תאי דם שלם בלי בידוד או הרחבה של סוג תא מסוים. יצרנו iPSCs בהצלחה רק 1x10 ⁴ תאים בצלחת תרבית ת...

Discussion

מאחר ותאי גזע עובריים (ESCs) הראו כמה חסרונות, את הצורך של כלי חלופי נדרש. לכן, הפיתוח של תאי גזע מושרים (iPSCs) על ידי יאמאנאקה בא תחת אור הזרקורים הבינלאומיים. זה כבר כמעט עשור מאז יאמאנאקה גילתה כי pluripotency יכול להיגרם על ידי הוספה רק ארבעה גנים לתוך תאי סומטיים מבוגרים. מאז ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer